Myogenic tone에서 protein kinase C 및 Rho A 단백질에 의한 Ca2+ sensitization의 역할

Abstract

[한글]Myogenic tone은 혈관내압의 변화에 따른 혈관평활근의 반응능력을 말하는 것으로 혈관내압이 증가했을 때 수축, 또는 역으로 혈관내압이 감소했을 때 혈관이 이완되는 것이다. 그러나 혈관내압의 변화에 따른 혈관 근육의 반응기전은 아직까지 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 rabbit basilar artery에서 myogenic tone의 형성에 PKC 및 Rho A 단백질에 의한 Ca2+ sensitization의 역할을 규명하고자 Fura-2 Ca2+ signal, 장력의 변화, PKC의 immunoblot, PKC 및 Rho A 단백질의 translocation 및 20KDa myosin light chain (MLC20) 인산화의 변화를 측정해본 결과 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. Ca2+이 존재하는 실험조건에서 rabbit basilar artery를 stretch 시켰을 때 세포내 Ca2+ 농도의 증가와 함께 장력이 증가되어 myogenic tone이 유발되었으나, 세포외액의 Ca2+이 제거된 상태에서는 세포내 Ca2+ 농도와 장력은 변화되지 않았다.

2. Stretch에 의한 세포내 Ca2+ 농도와 장력의 증가는 voltage-dependent Ca2+ channel 차단제인 nifedipine에 의해 억제되었으나 stretch-activated cation channel 차단제인 gadolinium에 의해서는 억제되지 않았다.

3. PKC 억제제인 H-7이나 calphostin C는 stretch에 의한 세포내 Ca2+ 농도와 장력의 증가를 억제하였으나, 세포내 Ca2+ 농도보다 장력을 더욱 더 현저하게 감소시켰다. Rho-kinase 억제제인 Y-27632는 stretch에 의한 세포내 Ca2+ 농도의 증가에는 아무런 영향이 없었으나 장력은 현저하게 감소시켰다.

4. Isoforms-specific antibody를 사용한 immunoblotting 결과 PKCα 및 PKCε isoform은 rabbit basilar artery에 존재하였으나, PKCα가 PKCε보다 많이 존재하였다. PKCβ 및 PKCι isoform은 존재하지 않았다.

5. PKCα는 혈관 조직의 stretch에 의해 세포질에서 세포막으로 translocation 하였으나 PKCε의 경우에는 translocation이 일어나지 않았다.

6. RhoA는 stretch를 가하지 않은 혈관조직에서는 세포질에 다량 존재하였으나 stretch에 의해 세포막으로 translocation 하였다.

7. MLC20 인산화를 측정한 결과 stretch는 MLC20 인산화를 증가시켰으나, 이러한 증가는 PKC 억제제인 H-7과 Rho-kinase 억제제인 Y-27632에 의해 억제되었다.

이상의 실험을 종합하여 볼 때 stretch에 의한 myogenic tone은 세포내 Ca2+ 농도의 증가와 Ca2+ sensitization에 의해 유발되며, PKCα와 Rho A 단백질에 의한 MLC20 인산화의 증가가 Ca2+ sensitization에 관여함을 알 수 있었다.

[영문]Myogenic tone refers to the ability of vascular smooth muscle to alter its state of contractility in response to changes of intraluminal pressure; the vessel constricts in opposition to an increase in intravascular pressure and dilates when the pressure decreases. The mechanisms by which vascular smooth muscle cells respond to changes in intravascular pressure are still not well understood. In this study, we investigated the role of PKC- or Rho A proteins-induced Ca2+ sensitization in myogenic tone of the rabbit basilar microcirculation by measuring Fura-2 Ca2+ signals, contractile responses, PKC immunoblots, translocation of the PKC and Rho A proteins, and phosphorylation of 20kDa myosin light chains.

Stretch evoked myogenic tone with increase in [Ca2+]i only in the presence of extracellular Ca2+. Stretch-induced increase in [Ca2+]i & contractions were completely abolished in the absence of extracellular Ca2+. Stretch-induced increase in [Ca2+]i & contractions were inhibited by treatment of tissue with nifedipine, blocker of voltage-dependent Ca2+ channel, but not in gadolinium, blocker of stretch-activated cation channel. PKC inhibitors, H-7 & calphostin C, and Rho-kinase inhibitor, Y-27632, inhibited a stretch-induced myogenic tone without changes in [Ca2+]i. Imunoblotting using isoenzyme-specific antibodies showed the presence of PKCα and PKCε in the rabbit basilar artery. PKCα, but not PKCε, and Rho A proteins were translocated from cytosol to the cell membrane by stretch. Phosphorylation of MLC20 was increased by stretch and these increases were blocked by treatment of tissue with H-7 & Y-27632.

These results suggest a link between the Ca2+ sensitization that occurs during the myogenic contraction and activation of the PKCα and Rho A proteins.