백서 간장의 fatty acid synthetase에 대한 cDNA 재결합과 E.coli에서 그 cloning에 대한 연구

Abstract

[한글]

Fatty acid synthetase (FAS)는 총 7개의 반응을 촉매하여 지방산 생합성에 관여하는 multifunctional enzyme으로서 lipogenic enzyme들 중 하나이다. 이 효소의 일차 구조 및효소 생합성 조절기전에 관한 연구에 필수적인 이 효소의 cDNA cloning이 최근에 활발히이루어지고 있으나, FAS의 크기가 너무커서 완전한 크기의 cDNA가 지금까지 cloning되지못하였다. 현재 이 효소의 C-끝쪽에 위치하는 acyl carrier polypeptide 부위와 thioesterase 부위가 cloning 되었으며, N-끝쪽의 나머지 부위는 cloning되지 못하였다. 따라서본인은 현재까지 cloning된 부위 이외의 다른 부위를 포함하는 FAS의 cDNA를 cloning하고자 본 실험에 착수하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

이틀간 굶긴 백서에 24시간 고함수탄소 식이를 투여한 후 간장을 적출하여 총 RNA를 분리하였으며, 이 RNA는 formamide agarose gel 전기영동 상에서 28S, 18S ribosomal RNA띠가 분명하게 나타나는 사실로 미루어, 저자가 분리한 총 RNA는 손상없음을 확인하였다.

이 총 RNA로부터 oligo(dT) cellulose chromatography로서 poly(A)-rich mRNA를 분리하였다. 이 mRNA는 A^^260/A^^280비가 1.9-2.1사이이었다.

이렇게 분리된 mRNA 3μg을 template로 하여 random hexamer를 primer로 첨가하고 avian myeloblastosis virus reverse transcriptase를 이용하여 제 1차 cDNA를 254ng 합성하였다. 제1차 cDNA를 template로 하여 제 2차 cDNA를 합성한 결과, 최종 합성된 double strand의 cDNA는 504 ng이었다. 이와같이 합성된 double strand의 cDNA를 alkaline agarose 전기영동으로 분석한 결과 합성된 cDNA크기는 0.5kb에서 9kb로 다양하였으며, 그 평균크기는 약 2kb 정도 이었다.

합성된 cDNA의 EcoRl 절단부위에 methylation시킨 후 EcoRl linker와 결합시키고, EcoRI 제한효소로 처리하여, 합성된 cDNA양끝에 EcoRI cohesive end를 만들었다. cDNA에 결합되지 않은 과량의 EcoRI linker는 Sephacryl S400 chromatography로 제거하였다.

탈인산화시킨 EcoRI cohesive end가 있는 λgt11 DNA에 본 실험에서 제조한 cDNA를 연결하여 백서 간장의 cDNA library를 제조한 결과, 이 library는 99%이상이 cDNA가 삽입되어 있었으며, 약 10**6개의 independent clone이 존재하였다..

Anti-FAS IgG를 사용하여 2×10**5개의 clone을 선별하여, FAS cDNA가 삽입된 clone을얻었다. 이들 clone을 반복하여 선별하여 8개의 순수한 clone(λFAS2,λFAS3, λFAS4,λFAS5, λFAS6, λFAS7, λFAS8, λFAS9)을 얻었다. 순수 분리된 FAS clone들로 부터 phage DNA를 분리하고 EcoRI 제한 효소를 처리한 결과, λFAS2와 λFAS3는 1.05kb, λFAS9는 1.3kb, λFAS7은 2 7kb의 FAS cDNA가 삽입되어 있었으며,λFAS5의 경우는 현재 백서로 부터 clone된 FAS cDNA보다 훨씬 큰 크기인 4.3kb의 cDNA가 삽입되어 있었다. 그러나 λFAS4, λFAS6, λFAS8은 EcoRI 제한 효소에 의해 phage DNA로 부터 cDNA가 절단되지 않았으며, 이는 아마도 cDNA 재결합시 EcoRI 제한 효소 절단 부위가 변형된 결과로 사료된다.

λFAS2, λFAS5, λFAS6, λFAS7 clone의 phage를 E. coli Y1089에 감염시켜, fusion단백질을 발현시킨 후 E. coli extract를 제조하여 SDS-polyacrylamide 전기영동 하고 Western blot을 한 결과 분자량 152 kDa에서 180 kDa에 해당하는 단백질띠가 anti-FAS IgG와 반응함을 확인하였다.

이상과 같이 백서 간장으로부터 분리한 mRNA를 가지고 cDNA를 제조하고, 이 cDNA를 λgtll expression phage vector에 재결합시켜, cDNA library를 제조하였으며, anti-FAS IgG를 사용하여 FAS cDNA clone을 선별하였으며, 이 clone된 phage를 E. coli Y1089에 감염시켜 FAS cDNA가 발현되는 사실을 Western blot을 통하여 최종적으로 확인하였다.

[영문]

Fatty acid synthetase which catalyzes the de novo biosynthesis of fatty acid is a multifunctional enzyme. Recently, the many studies have been devoted to clone cDNA of this enzyme, but because of its extraordinarily, large size, only the cloning of

C-terminus of FAS (ACP and thioesterase domain) was successful.

The study intended to clone the cDNA for the other domains of FAS, and the following results were obtained.

Total RNA was purified from the liver of the rat refed a high carbohydrate diet after the fasting for 2 days. From this total RNA, poly(A)-rich mRNA was isolated by oligo(dT) cellulose column chromatography and the ratio of A^^260/A^^280 was between 1.9 and 2.1 The first cDNA was synthesized by AMVRT with a random hexamer

as a primer from 3μg of mRNA as a template. and the second cDNA was synthesized by RNaseH and DNA polymerase I from the first cDNA as a template. The synthesized double stranded cDNA was 504 ng in heterogeneous size from 0.5 to 9kb. EcoRI linker was ligated to this cDNA after methylation by EcoRI methylase and excess linker not ligated to cDNA was removed by Sephacryl S400 chromatography after EcoRI digestion. This EcoRI cohesive-ended cDNA was ligated to λgtll phage DNA arm and packaged

with phage extract in vitro. This rat liver cDNA library contained the l0**6 independent clones of which 99% clones had cDNA inserts. By immunoscreening of 2x10**5 clones from cDNA library with anti-FAS IgG, 10 positive plaques were obtained. Finally 8 positive clones were isolated through rescreening these 10 FAS positive clones. Phage DNA was isolated from these 8 λFAS clones and EcoRI cDNA inserts were analyzed by agarose gel electrophoresis. Five clones (λFAS2, λFAS3, λFAS5, λFAS7, λFAS9) showed the EcoRI cDNA inserts, but 3 clones (λFAS4,

λFAS6, λFAS8) did not. The sizes of EcoRI cDNA inserts of λFAS2, λFAS3, λFAS5, λFAS7, and λFAS9 were 1.05, 1.05, 4.3, 2.7 and 1.3 kb, respectively. The cDNA insert of λFAS5 was larger than any other FAS cDNA cloned from rat to date and had

an internal EcoRI restriction site. The lysogen from λFAS2, λFAS5, λFAS6, and λFAS7 clones were prepared in E. coli Y1089 and the fusion proteins were confirmed by Western immunoblotting. The molecular weights of the fusion proteins were 152 kDa in λFAS2, 164 kDa in λFAS5 and 180kDa in both λFAS6 and λFAS7.

With these results, the cDNA for FAS was cloned using λgtll expression vector.