사람의 말초혈액 단구를 이용한 수상돌기세포 배양법의 비교 분석

Abstract

[한글]

수상돌기세포는 형태학적으로 수상돌기를 갖고 있으며 가장 강력한 항원전달 능력이 있어 T 림프구의 일차면역반응 및 T 림프구 매개 면역 반응에 가장 중요한 기능을 수행한다. 수상돌기세포는 항원 가공 능력이 발달되어있는 초기상태를 미성숙 수상돌기세포라 하며, 외부항원 등의 노출 후에 항원 가공 능력은 감소하고, T 림프구 자극능력 발달과 함께 동시 자극분자(costimulatory molecules) 및 CD83 등의 표면항원이 높이 발현되면 성숙 수상돌기세포라 한다. CD34+세포를 배양하면 수상돌기세포를 얻을 수 있으나, 혈액 내에 CD34+세포수가 적어 말초혈액에 비교적 많은 수로 존재하는 단구를 이용하여 두 단계의 세포 배양을 통해 성숙된 수상돌기세포를 얻는 방법이 고안되었다. 일차적으로 단구를 GM-CSF, IL-4를 첨가 배양하여 미성숙 수상돌기세포로 만들고, 여기에 면역글로불린에 부착된 단구에서 분비한 성분(monocyte conditioned medium, MCM)을 첨가하여 2일간 추가로 배양하면 성숙된 수상돌기세포로 배양할 수 있다. 그러나 이 방법은 MCM의 성분이나 농도가 일정하지 않아 그에 따른 실험 결과가 일관되지 않을 수 있어, 여러 사이토카인을 조합하여 배양하는 방법이 시도되고 있다. 본 연구에서는 말초혈액의 단구를 이용하여 성숙된 수상돌기세포를 배양하는 연구를 하였다. 미성숙 수상돌기세포로 일차 배양할 때, 이미 알려진 GM-CSF와 IL-4 외에 IL-13 및 c-kit ligand의 효과를 비교하였다. 성숙된 수상돌기세포를 얻기 위해 이차 배양 시 GM-CSF, IL-4만 넣은 군, MCM을 넣은 군 및 사이토카인 조합(GM-CSF, IL-4, IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE^^2)을 넣은 군으로 나누어 실험하고, 각각 얻어진 세포의 특성을 비교 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 말초혈액 단핵세포에서 단구를 얻을 때 면역 자기 구슬법과 세포유착법을 통해 얻은 세포의 특성은 분리직후 및 성숙 수상돌기세포로의 배양 후에도 분리 방법에 따른 차이가 없어, 세포유착법이 면역 자기 구슬법에 비해 간편한 분리 방법이라고 생각된다.

2. 단구를 미성숙 수상돌기세포로 일차 배양 시 GM-CSF, IL-4만을 투여하여 배양하거나, c-kit ligand를 추가로 첨가하거나, IL-4 대신 IL-13을 대신 첨가한 3가지 군에서 생성된 수상돌기세포의 수 및 표면항원(CDl4, B7-2, CD83)의 표현에 차이를 보이지 않았다.

3. 성숙 수상돌기세포의 배양 시 표면항원(CD83, B7-1, B7-2)의 발현은 GM-CSF와 IL-4로 배양한 군에 비하여 MCM과 사이토카인 조합을 넣고 배양한 군에서 높게 발현하였다. 사이토카인 조합으로 배양한 성숙 수상돌기세포와 MCM으로 배양한 세포간에 표면항원의 발현에는 차이를 보이지 않았다.

4. 배양세포의 형태학적인 관찰 시 일차 배양 1∼2일째부터 일부 세포에서 돌기가 관찰되며, 사이토카인 조합을 첨가하여 이차 배양 후, 배양 9일째에 수상돌기의 수가 많아지고 길이가 늘어나는 양상을 보여 성숙 수상돌기세포의 형태를 보였다.

5.사이토카인 조합으로 성숙된 수상돌기세포는 배양액에서 모든 사이토카인을 제거한 후 2일이 경과하여도 CD83의 발현이 유지되었다. 그리고 이종 혼합림프구 반응과 Staphylococcus enterotoxin B를 첨가한 항원 전달 능력 측정 실험에서 높은 반응을 보였다.

6. Dextran에 대한 세포내 이입은 단구에 비해 미성숙 수상돌기세포로 분화함에 따라 증가하였고, 성숙된 수상돌기세포로 분화한 후에는 다시 감소하는 경향을 보였다.

7. 세포배양액에 따라 수상돌기세포 표면항원에 차이가 관찰되었다. CD1a는 RPMI1640으로 배양하였을 때 높은 발현을 보였지만 X-VIVO 15에서는 전혀 발현을 보이지 않았다. B7-1과 CD83도 배양액에 따라 발현시기 및 형광도에서 차이를 보였지만 그 차이는 크지 않았다.

이상의 결과로 말초혈액 단구에서 미성숙 수상돌기세포로 일차 배양할 때, 이미 알려진 GM-CSF와 IL-4 외에 IL-13과 c-kit ligand의 사용에 따른 차이는 발견할 수 없었으며, 성숙 수상돌기세포로 이차 배양 시 사이토카인 조합(GM-CSF, IL-4, IL-1β,TNF-α, IL-6, PGE^^2)으로 배양하는 방법이 MCM을 이용하는 방법과 함께 성숙된 수상돌기세포를 효과적으로 얻을 수 있는 안정적인 방법임을 알 수 있었다.

[영문]

Dendritic cells (DC) are a system of highly efficient antigen-presenting cells that are capable of migration, that constitutively express MHC molecules, costimulatory and adhesion molecules, and that initiate the primary immuneresponse. Several laboratories have developed culture systems for human DC from

cells in the CD34+ fraction of human bone marrow and blood. Since the frequency of CD34+ cells in human blood is very low, this approach is less practical. Another alternative approach for DC culture is to use peripheral blood monocytes as starting cells. As a result, the two-step culture system for mature DC generation

from monocytes was established. In the first step, monocytes were grown in GM-CSF, IL-4 for 1 week to generate immature DC. In the second step, the so-called monocyte-conditioned medium (MCM) was used to induce final maturation of DC.

However, the composition of peripheral blood mononuclear cells in the producing MCM varies considerably and the quality of MCM also has unpredictable variations. Therefore, using a defined cocktail of growth factors far the generation of mature DC would be advantageous, but there has been a report that the cytokine cocktail was less effective than MCM in mediating the terminal maturation of DC.

In this study, we generated monocyte-derived DC according to the two-step culture system and compared the effects of cytokines in the first and second culture systems. The following results were obtained:

1. The number and Percentage of CD14+ cells by monocyte separation methods showed no difference between the cell attachment method and immunomagnetic bead separation.

2. In the first step culture, an alternative cytokine combination was used for DC culture; IL-4 was substituted by IL-13, and c-kit ligand was added to GM-CSF, IL-4. There were no differences of surface molecule expression between the alternative culture systems.

3. In the second step culture, mature DC cultured by cytokine cocktail (GM-CSF, IL-4,IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE^^2) showed a higher expression of CD83, B7-1 and B7-2 compared to GM-CSF, IL-4 generated DC which expressed little or no expression of CD83. The DC maturation specific marker CD83 expressed little difference between MCM and cytokine cocktail induced mature DCs.

4. The dendritic process was firstly seen at culture day 1 ∼2, it had increased in size and number by day 7, and it was larger and more numerous after fu11 maturation. Transmission electron microscopy showed no Berbeck granule-like structure in the immature and mature DC.

5. Cytokine cocktail-induced mature DCs expressed CD83 continuously after cytokine was removed for another 2 days. Cytokine cocktail-induced mature DCs showed potent stimulatory function in the mixed lymphocyte reaction and antigen presentation assay.

6. Endocytosis assay using dextran showed increased activity at first step culture, decreasing after full maturation.

7. There were great differences in CD1a expression between culture mediums, only DC cultured in RPMI 1640 medium expressed CDla, whereas there was no expression of CDla in X-VIV015.

From the results, it is suggested that combinations of both GM-CSF, IL-4 or GM-CSF, IL-13 could be used as a first-step DC culture, and that cytokine cocktail (GM-CSF, IL-4,IL-1β, TNF-α, IL-6, PGE^^2) was as efficient as MCM for the second step-culture to produce fully maturated DC.