가토 경동맥 외번모델에서 진드기 항응고펩타이드의 혈소판 기능 억제효과

Abstract

[한글]

동맥내의 경화반이 파열되거나 치료 목적의 술기도중 동맥이 손상되는 경우 혈소판 침착과 혈액응고계의 활성화가 동시에 진행됨으로써 혈전이 형성되어 급성으로 동맥 폐쇄가 유발되거나, 혈소판에서 유리되는 성장인자 및 혈액응고계의 활성화로 생성된 트롬빈(thrombin)이 내막증식을 유도하여 동맥협착을 초래한다. 손상된 혈관 내막에 침착된 혈소판은 혈액응고를 촉진하며, 혈액응고계의 산물인 트롬빈이 혈소판을 활성화하는 가운데 혈전형성이 더욱 가속화되므로, 트롬빈과 혈소판의 역할과 상호작용은 혈전의 발생에 매우 중요하다. 이 과정에서 발생하는 혈전을 억제하기 위해 여러 약제가 사용되고 있으나 그 효능에는 모두 각각의 한계가 있어, 더 효과적으로 혈전을 방지할 수 있는 새로운 약제가 요구되는 실정이다. 응고인자 Xa에 대한 선택적인 억제제로 최근 거론되고 있는 물질인 진드기 항응고 펩타이드(tick anticoagulant peptide: TAP로 약함)는 처음에 Ornithodoros moubata로부터 분리된 후 현재 유전자 재조합 기법으로 생산이 가능한 펩타이드로서, 몇몇 동물 모델을 대상으로 혈전을 억제하고 동맥 손상후 발생하는 협착을 줄이려는 연구가 진행되어 왔다.

이에 본 연구자는 동맥 손상시 발생하는 혈소판 침착에 의한 혈전형성과 유사한 기전을 보이는 가토 경동맥 외번모델에서, 트롬빈 생산을 억제하는 것으로 알려진 TAP의 혈소판 침착 억제효과를 알아보았다. 분리된 가토 경동맥 절편을 외번하여 관류계 내에서 indium-111이 부착된 혈소판만을 투여한 대조군(8예)과, indium-111이 부착된 혈소판과 TAP(15, 30, 100μg/ml)을 혼합하여 투여한 군(7예)의 혈소판 침착량을 방사성 동위원소 측정기를 이용하여 각각 조사하였다. 또한 혈소판 침착에 미치는 효과를 조직학적으로 알아보기 위해 혈관절편 내부를 주사 전자현미경으로 관찰하였다.

1. Labeling 전후에 평가한 혈소판 기능은 정상적으로 유지되었으며, 혈소판에 대한 indium-111 동위원소 표지율은 평균 87.8 ± 6.6%이었다. 관류된 혈소판 수는 평균 (± 표준편차: ISD) 4.3 (± 0.2) x 10**8 /ml이었다.

2. 대조군에서 침착된 혈소판 수는 평균 9.8 (± 2.5) x 10**8 /cm**2 로 동맥내로 관류된 혈소판 수의 23.9 (± 7.0)%이었다.

3. TAP 투여군에서 농도별로 측정한 침착 혈소판 수는 용량의존적으로 감소하였고(15μg/ml: 7.3 × 10**8 /cm**2 , 30μg/m1: 4.7 × 10**8 /cm**2 , 100μg/m1:3.3 × 10**8 /cm**2 ), 대조군에 대한 혈소판 침착 억제율은 용량의존적으로 증가하는 경향을 보였다(15μg/m1: 25.3%,30μg/m1: 52.4%, 100μg/ml: 66.8%).

4. TAP 100μg/m1 투여군(5예)에서 침착된 혈소판 수는 대조군(8예)에 비해 유의하게 낮았다(3.3 ± 0.6 vs 9.8 ± 2.5 (x 10**8 /cm**2 ), p=0.003).

5. 주사 전자현미경상 TAP 100μg/m1 투여군의 혈관 내부에 침착된 혈소판은 대조군에 비해 그 수가 현저히 적었다.

이상의 결과로 동맥손상과 유사한 가토 경동맥 외번모델에서 응고인자 Xa억제제인 TAP이 용량의존적으로 혈소판 침착을 억제함을 알 수 있었다. 이는 TAP이 프로트롬비나제 복합체(prothrombinase complex)의 형성을 억제하여 트롬빈 생성을 줄임으로써 궁극적으로 혈소판 활성화와 침착이 억제되기 때문으로 생각된다. 항응고제인 TAP이 혈소판 침착을 효과적으로 억제하는 결과는 TAP이 혈전형성 방지 및 혈전용해를 위해 단독 혹은 병합요법으로 사용될 수 있음을 시사하는 것으로 이에 대한 더 많은 연구가 필요할 것이다.

[영문]

Thrombin and its interaction with platelets have a central role in arterial thrombus development and stabilization. As the primary hemostatic plug is formed on an injured vessel, activated platelets accelerate plasma coagulation, and the products of the plasma coagulation reaction, such as thrombin, induce more platelet activation as a synergistic cycle. A variety of anticoagulants has been introduced to attenuate multiple steps in arterial thrombosis, however, efforts to find more effective molecules to inhibit the coagulation cascade are still on going. Now, factor Xa inhibitors, reducing generation of thrombin, are emerging as a possible molecule. Tick anticoagulant peptide(TAP), recently described selective factor Xa inhibitor, Is a 60-amino acid polypeptide originally isolated from the tick Ornithodoros moubata. The antithrombotic efficacy of a recombinant version of TAP has been demonstrated in several animal models.

In this study, we investigated the inhibitory effect of TAP on platelet deposition in a rabbit carotid artery eversion model of acute arterial thrombosis.

To observe the dose dependent inhibitory effects of TAP, the everted arterial segments were perfused with indium**[1] -labeled human platelets only(control, n=8), and a mixed solution of indium**[1] -labeled human platelets and TAP(15, 30, 100μg/m1, n=7). To evaluate the inhibitory effects of TAP on platelet deposition in the arterial eversion model, platelet deposition of TAP-perfused arteries(100μg/ml, n=5) was compared with those of control-group arteries.

Platelet deposition was calculated by a gamma-counter. At the end of the experiment, we evaluated arterial segments microscopically for pathologic examination. The following results were obtained:

1. Indium-[1] labeling efficiency of platelets was 87 (± 6.6)%, and the aggregation of platelets was normal without change after labeling. The mean number of platelets perfused through each artery was 4.3 (± 0.2) × 10**8 /ml.

2. The control group showed a mean number of platelet deposition of 9.8 (± 2.5)× 10**8 /cm**2 , and a platelet deposition rate of 23.9 (± 7.0)%.

3. The number of deposited platelets in TAP-perfused arteries decreased(15μg/ml:7.3 × 10**8 /cm**2 , 30μg/ml: 4.7 × 10**8 /cm**2 , 100μg/ml: 3.3 × 10**8/cm**2 ), with dose-dependent increase in platelet deposition reduction(15μg/m1:25.3%, 30μg/m1: 52.4%, 100μg/m1: 66.8%).

4. Platelet deposition of arteries perfused with TAP(100μg/ml, n=5) were significantly decreased compared to arteries of the control group(n=8)(3.3 ± 0.6 vs 9.8 ± 2.5 (× 10μ**8 /cm**2 ), p=0.003).

5. Scanning electron microscopic examination revealed significantly reduced platelet deposition along the arterial wall in TAP-perfused arteries compared with control arteries.

In conclusion, a highly selective and potent factor Xa inhibitor TAP was shown to effectively inhibit platelet deposition in a rabbit carotid artery eversion model.

The antithrombotic effects of TAP in this model suggest that factor Xa inhibition may be therapeutically useful in the prevention of acute arterial thrombus formation.