Retinoic acid와 cAMP에 의한 F9 기형암종 세포의 분화 유도시 세포 주기 조절 물질들의 변화

Abstract

[한글]

Retinoic acid(RA)/cyclic AMP (cAMP)에 의해 F9 세포의 분화가 유도된다는 사실은 RA/cAMP처리가 세포 주기 조절 물질들의 변화를 야기하여 F9 세포를 특정 세포 주기에서 성장을 멈추게 하고 정상 세포 주기로부터 이탈하게 할 수 있다는 가능성을 나타내므로 본 연구에서는 RA/cAMP처리가 F9세포의 분화를 유도할 때 세포 주기를 조절하는 물질들에 어떠한 변화를 일으킴으로써 F9 세포를 분화 경로로 이행하도록 하는지 그 기전을 밝혀보고자 하였다.

F9 세포는 10% festal calf serum을 포함한 Dulbecco's modified Eagle's medium으로 배양하였으며, 분화 유도제로서 10**-7 M의 all-trans-RA와 0.5 mM의 dibutyryl cyclic AMP를 사용하여 각각의 분화제를 처리한 군과 두 분화제를 동시에 처리한 군으로 나누어 0, 24, 48, 72, 96시간동안 배양한 후 세포 주기 조절 단백질들의 양적 변화를 western blot 면역 염색을 이용하여 확인하였다. Tryphan blue dye exclusion 방법을 이용하여 세포의 수를 측정하여 성장 속도를 확인하였으며, 세포를 propidium iodide로 염색한 후 flow cytometry를 이용하여 세포 주기 분포의 변화를 알아보았다. Cyclin dependent kinase(cdk)의 활성 변화를 알아보기 위하여 histone Hl및 Rb kinase 분석을 시행하였고, (**32P)-orthorhosphate를 이용하여 F9 세포의 단백질을 대사적으로 표지시켜 cdk의 인산화 정도의 변화를 확인하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

F9 세포는 RA/cAMP처리에 의해서 분화가 유도되어 분화된 형태를 나타내었으며, 그 성장률은 대조군 세포에 비해 30% 이하로 감소하였고 F9 세포 고유의 세포 주기 분포 양상에서 벗어나 점차 Gl 기가 증가하였다. 세포 주기 조절 물질들의 양적 변화를 확인한 결과 cyclin D1은 RA 및 RA/cAMP를 처리하고 72시간 이후에 급격히 감소하였으며, cyclin D3도 같은 양상을 보였으나 그 감소의 정도는 미미하였으며, cyclin A 및 cyclin E는 양적인 변화를 관찰할 수 없었다. Cdk의 양적 변화를 확인한 결과 cdk2, cdk4 및 cdk6의 변화

는 관찰할 수 없었으며, cdk2 및 cdk4의 억제자 중 p21WAF1은 RA와 RA/cAMP를 처리한 세포의 경우에서는 시간이 경과함에 따라 그 양이 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, p27kip1의 경우에서는 cAMP를 처리한 세포에서 그 발현양이 RA를 처리한 세포에서의 양에 비해 상대적으로 증가되어 있었으며, RA/cAMP를 처리한 세포에서도 양적으로 증가한 양상을 관찰할 수 있었다. Cdk2, cdk4 및 cdk6의 활성을 조사한 결과 cdk2의 활성은 모든 경우에서 24시간 이후 감소하는 경향을 보였으나, cdk4 및 cdk6의 활성은 관찰할 수 없었다. 분화 유도제를 처리하지 않은 활발히 성장하는 F9 세포에서도 cdk4 및 cdk6의 활성을 확인할 수 없었으므로 F9 세포에서는 cdk4 및 cdk6이 구조적으로 활성이 억제되어 있는 것으로 생각되었으며, 그 불활성의 원인은 cdk4 또는 cdk6의 14번째 threonine 또는 15번째 tyrosine이 구조적으로 인산화된 상태로 존재하며, 세포 주기의 진행 여부에 따라 인산화-탈인산화의 조절이 이루어지지 않기 때문인 것으로 생각되었다. 또한 Rb단백질의 양적 변화를 관찰할 수 없었으며, 인산화 상태의 변화도 관찰할 수 없었다.

이상의 결과를 종합하면 RA/cAMP처리에 의해 F9세포가 분화될 때 정상적인 세포 주기에서 벗어나 분화 과정으로 이행하는 이유는 cdk2의 억제자인 p21WAF1과 p27Kip1의 증가로 인하여 cdk2의 활성이 억제됨으로써 G1 기에서 S 기로의 이행이 억제 받기 때문으로 생각

되었다. 한편 구조적으로 cdk4 및 cdk6이 불활성화 상태를 유지하고 있는 F9 세포가 세포 성장을 지속할 수 있는 이유는 cyclin E의 지속적인 발현에 따라 pRb/E2F경로의 활성화를 거치지 않고서 다음 단계의 세포 주기를 진행할 수 있기 때문인 것으로 생각된다.

[영문]

F9 cells can be differentiated into variable cell types according to culture condition and drugs used in inducing differentiation. For example, RA only can differentiate F9 cells into visceral endoderm like cells and RA/cAMP treatment can induce differentiation of F9 cells into parietal endoderm-like cells. Progression from G1 to S phase of mammalian cell cycle is regulated by cyclin D dependent kinases cdk4 and cdk6 complexed to D type cyclins, and by cdk2 bound to cyclins E or A. Apart from reflecting cyclin accumulation and binding, cdk activity is regulated by negative and positive phosphorylation events and interactions with cdk inhibitors. Cdk inhibitors of the p16INK4 family specifically inhibit cdk4 and cdk6, whereas members of p21WAF1/p27Kip1 family inhibit a broader spectrum of cdks.

When cells differentiate, they withdraw from the cell cycle to carry out their specialized functions and cell cycle regulatory proteins are often targeted for inactivation during cell cycle withdrawal.

Thus, to investigate the changes of the cell cycle regulatory molecules in the course of differentiation, F9 cells are used as a model system and RA/cAMP are used to induce differentiation.

F9 cells were grown in DMEM containing 10% fetal calf seam at 37℃ in a humidified atmosphere of 5% CO^^2 in air. All-trans-RA (10**-7M) or dbcAMP (0.5 mM) was added to the culture to induce differentiation and then, cultures were maintained for 24, 48, 72, and 96 hours. Proteins were isolated at each time point and western blot immunostaining was dane to examine the changes in the level of expression of cell cycle regulatory proteins. To monitor the cell growth rate, viable cells were counted by using tryphan blue dye exclusion method and to monitor the change of cell cycle distribution, cells were stained with propidium iodide and then, analyzed with flow cytometry. The activity of cdk was checked by histone H1 or Rb kinase assay, and phosphorylation status of cdk was checked by metabolic labelling of proteins with [**32p]-orthophosphate followed by immunoprecipitation with anti-cdk2 or anti-cdk4 antibody.

Through these experiments, we obtained following results.

First, F9 cells showed morphologically differentiated phenotype after 96 hours treatment of RA/cAMP and the growth was inhibited up to 30% that of control cells. Moreover, cell cycle phase distribution was changed in a way that the S phase was reduced and Gl phase was gradually prolonged.

Second, we examined the expression level of cell cycle regulatory proteins.

In case of cyclin A or E, the important cyclins for transition from G1 to S phase, no change was observed in the expession level regardless of the treatment or time. Cyclin D1 and D3, however, decreased after 72 hours of treatment of RA or Rf/cAMP treatment.

Third, although the expression level of cdk2, cdk4 or cdk6 were maintained without any changes, the activity of cdk2 was down regulated after 24 hours of each treatment but unexpectedly, we could not detect any activity of cdk4 or cdk6. Moreover, cdk2 was rarely phosphorylated and showed no change but cdk4 was phosphorylated regardless of treatment and time, even in the control cells.

Fourth, the cdk inhibitors were examined. In case of p21WAF1, the expression was up regulated in RA or RA/cAMP treated cells but there was no change in cAMP treated cells. In case of p27Kip1, the expression was more elevated in the cAMP and RA/cAMP

treated cells than in RA treated cells.

Fifth, the expression level and the phosphorylation status of pRb showed no change.

Taken together these results, we concluded that cdk2 inactivation by up-regulation of cdk inhibitor, p21WAFl and p27Kip1, is the main event for RA/cAMP treatment to induce differentiation of F9 cells. In addition cdk4 and cdk6 were constitutively inactivated in F9 cells possibly by inhibitory phosphorylation of cdk and thus, to maintain the cell cycle of F9, cells should adopt another mechanism bypassing pRb/E2F activation pathway, arid it could be achieved by sustained expression of cyclin E and associated kinases.