Autocrine Vascular Endothelial Growth Factor Enhances Survival of Retinal Pigment Epithelium Cells under Oxidative Stress via the VEGF R-2/PI3K/Akt

Abstract

[한글]혈관내피세포성장인자 (Vascular endothelial growth factor; VEGF)

는 산화스트레스 하에서 망막색소상피에서 강하게 분비되며, VEGF는

여러가지 종류의 세포들에 있어서 생존인자로 작용하는 사실이 알려

져 있다. 본 연구에서는 망막색소상피에서 분비되는 VEGF가 오토크

라인 생존 시그널을 활성화하여 산화스트레스 하에서 생존을 위한 적

응 과정임을 확인하고자 하였다.

ARPE-19 세포주를 이용하여 과산화수소를 이용하여 산화스트레스

에 의한 세포사를 annexin V-fluorescein isothiocyanate를 이용한

flow cytometric analysis를 통하여 정량하였다. VEGF에 대한 중화항

체를 이용하거나, VEGF 수용체 타이로신 인산화 억제제를 이용하거

나, VEGF 수용체를 중화하는 항체들을 이용하여 전처치 후 산화스트

레스를 가하여 생존률을 측정하였다. 또한, 준 정량적인 RT-PCR이나 Western blot을 이용하여 VEGF, VEGF R1, VEGF R2의 발현이 산화

스트레스 하에서 증가함을 확인하였다. 망막색소상피에서 VEGF R2의

인산화를 측정하기 위하여 면역침강후 Western blot을 시행하였다.

과산화수소에 의한 세포사는 VEGF에 대한 중화항체나 VEGF R2에

대한 중화항체를 전처치 하였을 때 의미있게 증가되는 소견을 보였다.

산화스트레스에 의한 VEGF R2의 인산화는 VEGF에 대한 중화항체를

전처치 하였을 때에는 감소되었다. Akt의 인산화 역시 전 처치시에

감소하였다.

산화스트레스 하에서 오토크라인하게 망막색소상피에서 분비되는

VEGF는 VEGF R2/PI3K/Akt pathway를 통하여 세포의 생존에 관여

하는 것으로 보인다. 현재에도 노인성 황반변성에서 널리 사용되는

VEGF를 중화하는 치료는 망막색소상피의 생존에 영향을 줄 가능성

이 있다.

[영문]Purpose: Vascular endothelial cell growth factor (VEGF) is strongly induced by oxidative stress in retinal pigment epithelium (RPE) cells and VEGF-A is a survival factor for various cell types, thus, we examine whether the autocrine VEGF signal pathway in RPE cells is involved in the mechanism of adaptive response to oxidative stress. Methods: ARPE-19 cells were treated with hydrogen peroxide and cell death was measured with flow cytometric analysis with annexin V- fluorescein isothiocyanate. Survival analysis was performed with pretreatment of VEGF-A neutralizing antibodies, VEGF receptor tyrosine kinase inhibitor (SU5416) or VEGF-A receptor neutralizing antibodies (anti-VEGF R1, anti-VEGF R2). Expression of VEGF-A, VEGF R1, VEGF R2 and soluble VEGF R1 was determined by semiquantitative RT-PCR or Western blot. Phosphorylation of VEGF R2 was detected with immunoprecipitation and immunoblot. Results: Hydrogen peroxide-induced cell death was promoted by pretreatment with VEGF-A neutralizing antibody and anti-VEGF R2 neutralizing antibody, but not with use of anti-VEGF R1 neutralizing antibody. Phosphorylation of VEGF R2 in RPE cells was induced by hydrogen peroxide and pretreatment with anti-VEGF-A neutralizing antibody inhibited phosphorylation. Phosphorylation of Akt under oxidative stress was abrogated by pretreatment with either neutralizing antibodies against VEGF-A or SU5416. Conclusions: Autocrine VEGF-A enhanced RPE cell survival under oxidative stress; the autocrine VEGF-A/VEGF R2/PI3K/Akt pathway is involved. Neutralization of VEGF-A signaling, as in age-related macular degeneration eyes, may influence RPE cell survival.