Agmatine pretreatment attenuates retinal ganglion cell death by an oxidative stress

Abstract

[한글]

본 연구에서는 쥐의 망막신경절세포주(RGC-5 cell)를 대상으로 산화스트레스에 대한 L-아르기닌의 탈탄산화에 의해 형성되는 풀리아민인 아그마틴의 전처치 보호효과를 살펴보고자 하였다. 스타우로스포린의 첨가에 의해 분화시킨 RGC-5 세포에 아그마틴 전처치를 시행하고 세포배양액에 과산화수소를 첨가하여 산화스트레스를 유발하였다. 세포사멸은 유산염탈수소효소 분석을 이용하여 평가하였으며, 세포고사는 TUNEL분석과 caspase-3 및 -9 분석으로 평가하였다. 또한, Bcl-2 family (Bcl-2, Bcl-xl, Bax와 Bad)와 MAPKs (ERK p44/42, JNK, p38) 단백질의 총량과 인산화 정도는 웨스턴면역분석법을 이용하여 확인하였고, Bcl-2 family의 mRNA 발현은 real time RT-PCR을 이용하여 검토하였다. 1 μM 스타우로스포린에 6시간 동안 노출하여 분화시킨 RGC-5 세포를 2시간 동안 100 μM 아그마틴으로 전처치한 후 1.0 mM 과산화수소에 16시간 동안 노출시켜 산화스트레스를 유발하였을 때, 세포사멸은 40.9 %에서 27.3 %로 감소하였다. TUNEL분석을 이용하여 이러한 산화스트레스로 인한 RGC-5 세포의 사멸이 세포고사에 의한 것임을 알 수 있었으며 아그마틴 전처치에 의해 감소됨을 알 수 있었다. 하지만, 아그마틴 전처치에 의한 caspase-3 및 -9의 활성 변화는 관찰되지 않았다. 이러한 아그마틴 전처치의 효과는 yohimbine에 의해 완전하게 억제되었지만, 글루타민산염 또는 NMDA에 의해서는 부분적으로만 억제되었다. 또한, Bcl-2 family 및 MAPKs 단백질의 총량은 산화스트레스의 영향을 받지 않았고, Bcl-2 family의 mRNA도 변화하지 않았다. 하지만 아그마틴 전처치 후 산화스트레스를 유발하였을 때는 MAPKs 중 JNK의 인산화가 억제되었다. 본 연구를 통하여 분화된 RGC-5 세포에서 산화스트레스를 유발하였을 때 아그마틴 전처치가 신경보호 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

[영문]Purpose; To investigate the protective effects of agmatine pretreatment on oxidative stress in immortalized and differentiated rat retinal ganglion cell line (RGC-5 cells).

Method; RGC-5 cells were differentiated by staurosporine, cultured in the presence of hydrogen peroxide (H2O2) with or without pretreatment of agmatine. Cell viability was determined by lactate dehydrogenase (LDH) assay. Apoptosis was examined by TUNEL assay and caspase-3 and -9 assays. Total and phosphorylated Bcl-2 family proteins (Bcl-2, Bcl-xl, Bax, and Bad) and mitogen-activated protein kinases (MAPKs; ERK p44/42, JNK, and p38) were investigated by Western blot analysis. Also mRNA expressions of Bcl-2 family were examined by quantitative real time RT-PCR.

Results; RGC-5 cells, differentiated by 1.0 μM staurosporine for 6 hours and recovered for 3 days, contained fully developed neurites and were well connected with each other. Under H2O2 oxidative stress, agmatine pretreatment for 2 hours enhanced cell survival dose dependently. The cytotoxicity assay showed 40.9 % cell loss, which was reduced to 27.3 % when the cells were pretreated by 100 μM agmatine for 2 hours followed by 1.0 mM H2O2 treatment for 16 hours. This cell loss was due to apoptotic cell death, as established by TUNEL assay, but was neither caspase-3 nor caspase-9 dependent. The effect of agmatine pretreatment was completely inhibited by yohimbine, but partially decreased by glutamate or NMDA. Total expression of Bcl-2 family proteins and MAPKs were not influenced by H2O2 oxidative stress. Also mRNAs of Bcl-2 family were not changed. In contrast, the phosphorylation of JNK was suppressed by agmatine pretreatment followed by H2O2 oxidative stress.

Conclusion; The present study shows that agmatine had neuroprotective effects on oxidative stressed differentiated RGC-5 cells. It might suggest a therapeutic strategy for many ocular diseases associated with oxidative stress.