Specific differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by regulation of protein kinase system

Abstract

[한글]현재까지 알려진 많은 신호 기전을 조절하는 단백질들 중 하나인 단백질 키나아제는 줄기세포의 분화 조절에서 중요한 역할을 할 수 있으며 이는 세포의 운명과 같은 중요한 생물학적 과정이 다양한 신호기전의 섬세한 조합에 의해 결정되어지기 때문이다. 게다가, 단백질 키나아제의 활성을 조절하는 세포 투과성 저분자화합물은 특정 단백질의 기능을 시간적, 양적 그리고 모듈단위로 조절할 수 있는 장점을 가지고 있다. 따라서 본 연구에서는 간엽줄기세포의 분화를 체계적으로 조절하는 화학물질과 기전에 대해 알아보고자 하였으며 다양한 신호기전의 조합을 조절할 수 있는 주요한 단백질 키나아제 군의 억제제 스크리닝을 통해 몇몇 단백질 키나아제가 간엽줄기세포의 분화에 상당한 영향을 미침을 발견하였다. 우선, PKA 억제제인 H-89를 줄기세포에 처리한 결과, 생체외에서 연골세포로의 분화과정이 증진되었다. H-89를 처리한 뒤 연골세포로의 분화 정도를 측정하는 alcian blue 염색 정도가 증가하였다. 다양한 농도 (0.1-1 μM)의 H-89를 간엽줄기세포에 처리할 경우, 연골세포의 세포외 기질에 존재하는 단백질들 중 하나인 aggrecan의 발현이 유도되었다. 간엽줄기세포가 연골세포로 분화되는 과정에서 ERK의 활성은 증가하였으나 H-89과 U0126을 동시에 처리할 경우 ERK의 활성은 증가하지 않았다. 연골세포로의 분화과정에서 세포 생착과 관련된 분자의 발현에서 상당한 변화가 유발됨을 RT-PCR을 통해 확인하였다. PKC 활성제인 phorbol myristate acetate (PMA)의 처리는 간엽줄기세포에서 심근세포의 특이적 표현인자 (cardiac troponin T, myosin light chain, myosin heavy chain, NK2 transcription factor-related, locus 5, 그리고 Myocyte-specific enhancer factor 2)의 발현을 유발시켰다. 분화 유도된 심근세포는 기능인자인 adrenergic과 muscarinic 수용체가 발현되고 norepinephrine을 처리하면 발현된 α1-adrenergic 수용체를 통해 ERK의 인산화가 유발되었다. 칼슘 관련 인자(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 그리고 L-type Ca2+ channel)의 mRNA 발현 수준은 분화 유도된 간엽줄기세포와 심근세포에서 유사성을 보였다. GSK-3β inhibitor 처리에 의해 내피유사세포로의 분화가 유도되었으며 분화 유도된 세포는 내피세포의 특이적 표현인자(CD31, CD34, eNOS, VE-cadherin, VCAM-1, 그리고 VEGF-R2) 발현의 상당히 증가하였으며, 또 모세혈관과 유사한 구조의 형성과 같은 기능적 특성을 보였다. 간엽줄기세포에 GSK-3β inhibitor를 처리하면 세포주기 중 S기가 감소하고 전반적으로 생육이 저하되었다. 신호 물질의 분석을 통해 GSK-3β inhibitor 처리에 의한 내피세포로의 분화에는 GSK-3β/β-catenin 하위신호기전이 관련되어 있음을 알 수 있었다. 본 연구는 단백질 키나아제의 조절이 간엽줄기세포의 체계적인 분화 조절 방법이 될 수 있으며 이 체계는 간엽줄기세포에 대한 학문적 이해와 새로운 재생의학의 발달에 기여할 것으로 기대된다.

[영문]Protein kinases, the members of a large family of proteins involved in modulating many known signaling pathways, are likely to play important roles in regulating stem cell differentiation programs because important bio-processes such as cell fate are likely to be determined by an elaborate orchestration of multiple signaling pathways. In addition, cell permeable small molecules to modulate activation of protein kinase have several merits that include the ability for temporal, tunable and modular control of specific protein function. Therefore, research efforts focused on search for chemical reagent and mechanism that regulates systematic differentiation of MSCs. It was found that some of protein kinase cause recognizable changes in differentiation rates of MSCs based on screening inhibitors of major protein kinase subfamilies to alter the orchestration of multiple signaling pathways. At first, chondrogenesis of MSCs in vitro was significantly improved in cells treated with H-89, a PKA inhibitor. After treatment of H-89, the data of alcian blue staining assay for the quantitation of chondrogenesis was increased. Aggrecan, one of the extracellular matrix genes in chondrocytes, was induced in MSCs treated with various concentrations of H-89 (0.1?1 μM). During chondrogenesis of MSC, activation of ERKs was increased in MSCs treated with H-89 but cotreatment with H-89 and U0126 did not lead to a change in ERK activation. Semiquantitative RT-PCR showed a significantly changed level of cell adhesion molecule during chondrogenesis. MSCs gave rise to cardiomyocytes expressing of cardiac-specific markers (cardiac troponin T, myosin light chain, myosin heavy chain, NK2 transcription factor-related, locus 5, and Myocyte-specific enhancer factor 2) by addition of phorbol myristate acetate (PMA), a PKC activator. Differentiated cardiomyocytes expressed functional adrenergic and muscarinic receptors and norepinephrine induced phosphorylation of ERK via α1-adrenoceptors. The mRNA level of Ca2+-related factor (sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, L-type Ca2+ channel) in differentiated MSCs was similar to that in cardiomyocytes. Differentiation into endothelial-like cells was induced by cultivation of cells in the presence of GSK-3β inhibitor. The differentiated cells showed a strong increase of expression of endothelial-specific markers (CD31, CD34, eNOS, VE-cadherin, VCAM-1, and VEGF-R2) and functional behavior of endothelial cells such as a formation of capillary-like structure. Treatment of proliferating MSCs with GSK-3β inhibitor leads to depletion of S-phase cells and over all decreased proliferation. The differentiation of MSCs into endothelial-like cells by the treatment of GSK-3β inhibitor was associated with GSK-3β/β-catenin signaling. The current study suggests that the regulation of protein kinase may emerge as a remarkable tool for systematic differentiation of MSCs. This system would greatly contribute to a novel understanding of MSC biology and the development of novel regenerative medicine.