Trima Accel의 leukoreduction chamber내 세포의 성상분석과 수지상세포의 분화유도

Abstract

[한글]인체유래 백혈구를 연구용으로 얻는 것은 용이하지 않다. 일반적으로 연구용으로 사용된 백혈구 소재는 전혈로부터 얻어낸 백혈구연층(buffy coat)이나 백혈구제거용 필터에 걸러진 백혈구층을 모아서 연구용으로 사용하여 왔으며 최근에는 성분헌혈채집기인 Trima Accel？ (CaridianBCT, Lakewood, CO, USA)의 LRS chamber내 세포가 새로운 연구 소재라고 소개된 바 있다. 본 연구에서는 Trima Accel？의 LRS chamber내 백혈구 구성만을 분석하였던 기존 보고에 비해 LRS chamber내에 모아진 세포의 면역학적 분석과 연구용의 활용 가능성을 확인하고자 수지상세포로의 분화실험을 통하여 그 기능성을 평가하였다.

건강한 성인 26명으로부터 동의를 받고 Trima Accel？을 이용하여 혈소판 성분채집을 실시한 후 폐기되는 채집 kit에서 LRS chamber를 분리하였다. LRS chamber내 세포수를 측정하였고 T세포, B세포, NK세포, CD14+세포의 구성성분을 유세포분석기를 이용하여 분석하였으며, Stem kit？ (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA)를 사용하여 CD34+세포수를 측정하였다. MACS？ Seperation (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA)로 CD14+세포를 분리하였으며 GM-CSF와 IL-4를 첨가하여 5일간 배양하고 2일간 TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE2로 자극하여 수지상세포의 성숙을 유도하였다.

LRS chamber내의 총백혈구수는 10.8 x 108 (범위 7.7 x 108 - 18.0 x 108) 였으며, T세포, B세포, NK세포, CD14+세포의 백분율은 총백혈구의 61.1% (범위 31.6 - 66.1), 5.5% (범위 2.2 - 12.1), 15.7% (범위 13.7 - 19.9), 12.4% (범위 8.6 - 32.3)였다. 대조군으로 비교한 기존의 400 mL 전혈유래 백혈구연층으로부터 회수한 총백혈구수는 14.9 x 108 (범위 10.5 x 108 - 22.0 x 108 )였다. T세포, B세포, NK세포, CD14+세포의 백분율은 총백혈구의 65.5% (범위 31.6 - 66.1), 10.2% (범위 3.4 - 16.2), 12.9% (범위 4.8 - 26.5), 8.7% (범위 3.2 - 15.2)였다. 두 그룹간에 총백혈구수에 통계학적으로 유의한 차이가 있었으나, 림프구와 단핵구수는 통계학적인 차이가 없이 비등한 세포수를 가지고 있었다. 특히 CD4+세포수와 B세포수가 두 그룹간에 통계학적으로 유의한 차이가 있었다(p<0.05). CD34+세포수가 말초혈액인데도 불구하고 0.95 x 106 (범위 0.15 x 106 - 2.60 x 106)가 포함되어 있었다. CD14+세포는 7일동안 배양하여 수지상세포로 분화 및 성숙함을 확인하였다. 폐기되는 세포를 회수함으로 백혈구계의 연구를 진행하는데 있어서 좋은 세포원임을 알 수 있었다. Trima Accel？의 LRS chamber에는 단핵구와 림프구가 풍부하였다. 생존력과 기능성을 가진 세포들로 구성되어 있어서 세포의 재활용 측면에서 뿐 아니라 백혈구 특히 림프구를 이용한 독성실험 연구, 수지상세포의 연구 소재, 그리고 CD34+양성세포를 얻을 수 있음으로서 말초혈액을 이용한 줄기세포 연구용 소재로도 매우 유용할 것으로 판단되었다.

[영문]Procurement of large numbers of human cells for research purposes poses a challenge for researchers. Traditionally, standard buffy coats centrifugated from whole blood and WBCs separated from leukocyte removal filters have been used for scientific study. Recently, some studies reported a novel source of viable peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) from leukoreduction system (LRS) chamber of Trima Accel？ (CaridianBCT, Lakewood, CO, USA). In this study, we investigated the proportion of cellular components, and the viability and function of PBMNCs via a generation of dendritic cells from mononuclear cells remaining in the LRS chambers of Trima Accel？.

Twenty six LRS chambers of Trima Accel？, which were discarded after plateletapheresis, were collected. The immunophenotypic characteristics of leukocytes such as T cell, B cell, NK cell and CD14+ cell components were analysed by flow cytometry. CD34+ cells were counted with Stem kit？ (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA). Differentiation and maturation of CD14+ cells seperated via MACS？ Seperation (Miltenyi Biotec Inc. Auburn, CA, USA) into dendritic cells were induced.

Total white blood cell (WBC) counts in LRS chambers were 10.8 x 108 (range 7.7 x 108 - 18.0 x 108). The proportions of T cells, B cells, NK cells and CD14+ cells were 61.1% (range 31.6 - 66.1), 5.5% (range 2.2 - 12.1), 15.7% (range 13.7 - 19.9) and 12.4% (range 8.6 - 32.3) of total WBC in LRS chambers, respectively. In control group of buffy coats centrifugated from 400 mL of whole blood, total WBC counts were 14.9 x 108 (range 10.5 x 108 - 22.0 x 108). The proportions of T cells, B cells, NK cells and CD14+ cells in control group were 65.5% (range 31.6 - 66.1), 10.2% (range 3.4 - 16.2), 12.9% (range 4.8 - 26.5) and 8.7% (range 3.2 - 15.2), respectively. Although there were significant difference in the total number of WBC between the two groups by Mann-Whitney U test, the number of lymphocytes and monocytes were not considered statistically different. The number of B cells and CD4+ cells in LRS chambers were significantly higher than that of the buffy coat centrifugated from the whole blood (p<0.05). The mean total count of CD34+ cells obtained from the LRS chambers was 0.95 x 106, ranging from 0.15 x 106 to 2.60 x 106. No dead cells stained with 7-AAD were detected by flow cytometry analysis. After 7 days in cytokine supplemented culture, the CD14+ cells were differentiated into dendritic cells.

The PBMNCs in LRS chambers had plenty of lymphocytes and monocytes and were an abundant source of viable and functional human cells. Therefore, the cells in LRS chambers are useful in studies of the diverse immunotherapies using lymphocytes and dendritic cells as well as in studies using CD34+ hematopoietic stem cells. Furthermore, the cells in LRS chambers are used in cell recycling.