UTP stimulates chloride secretion via CFTR and Ca2+-activated chloride channels in cultured human middle ear epithelial cells

Abstract

[한글]목적: 중이점막에서 이온 채널은 수분의 흡수와 분비에 결정적인 역할을 한다. P2Y 퓨린수용체에 세포외 핵산이 결합하여 수분과 이온의 이동을 조절하는데 관여한다. 본 연구에서는 배양된 사람 중이점막상피세포에서 P2Y2 수용체 작용제인 uridine-5’-triphosphate (UTP)가 Chloride (Cl-) 이온의 분비를 촉진시키는 기전에 대해 알아보고자 한다. 재료 및 방법: 사람 중이점막상피세포를 채취하여 계대 배양하여 air-liquid interface에서 분화를 유도한 후, 경상피 이온 이동을 확인하기 위해 Ussing chamber에서 voltage clamp상태에서 단락 전류 (short-circuit current, Isc)를 측정하였다. Ca2+-activated chloride channels (CACC) 의 발현을 확인하기 위해 RT-PCR을 시행하였다. 결과: 사람 중이점막상피세포에서 amiloride를 처치한 후, 첨부 측 관류액에 UTP를 첨가하였을 경우 Cl- 분비에 의해 Isc 가 일시적으로 급상승하여 지속되는 반응을 확인할 수 있었다. Cl- 채널 길항제를 첨부 측 관류액에 추가하였을 경우 UTP에 의한 Isc가 억제되었다. CACC의 억제제로 알려진 niflumic acid와 CFTR의 선택적 억제제인 CFTRinh-172를 처치한 경우 각각 UTP에 의해 유도된 Isc가 부분적으로 억제되었다. 칼슘 킬레이트 제제인 BAPTA-AM 를 첨가할 경우 UTP에 의한 CACC 활성화가 억제되었고, PKC를 억제하면 Cl- 분비에 의한 Isc가 억제되었다. CACC mRNA 발현을 확인할 수 있었다. 결론: 기도 점막에서 Cl- 이온의 이동은 수분 의 이동 조절에 중요하며, P2Y2 수용체 자극시 anion 분비가 촉진되는 것이 알려져 있다. 본 연구에서 사람 중이점막상피세포에서 P2Y2 수용체 작용제인 UTP에 의해 Cl- 이온 분비가 촉진되며, 이는 CACC와 CFTR에 의한 부분이 모두 증가되는 것으로 이해된다. 또한 UTP에 의해 유도된 Cl- 이온 분비가 PKC와 연관되어 있다는 것을 알 수 있었다.

[영문]OBJECTIVE Nucleotide binding to purinergic P2Y receptors contributes to the regulation of fluid and ion transport in middle ear epithelial cells. Here, we investigated the regulatory mechanism of the P2Y2 receptor agonist uridine-5’-triphosphate (UTP) on Cl- transport in cultured normal human middle ear (NHMEE) cells. METHODS Monolayers of cultured NHMEE cells were mounted in Ussing chambers to perform electrophysiological measurements. Molecular expression of Ca2+-activated chloride channels (CACC) was examined by RT-PCR. RESULTS Apical addition of UTP in presence of amiloride evoked a transient rise and a sustained response in short circuit currents (Isc) due to Cl- efflux. Application of different chloride channel blockers to the apical side of the tissues was able to significantly decrease UTP-induced Isc. Niflumic acid (NFA), a known blocker of CACC, and CFTRinh-172, a selective inhibitor of CFTR, partially inhibited the UTP-induced Cl- secretion respectively. Calcium-chelating agent BAPTA-AM blocked the UTP-induced activation of CACC. Inhibition of PKC reduced UTP-dependent stimulation of Cl- efflux. CACC mRNA expression was confirmed by RT-PCR. DISCUSSION & CONCLUSION Cl- transport across airway epithelia plays a predominant role in regulating airway hydration. Nucleotides are known to stimulate anion secretion across airway epithelia by acting on P2Y receptors on the apical membrane. In this study, the P2Y2 receptor agonist UTP is shown to increase both CACC and CFTR-dependent Cl- secretion in NHMEE cells, and that the PKC pathway is involved in CFTR activation in human middle ear epithelial cells.