Sequential addition of proinflammatory cytokine cocktail and poly(I:C) potentiates human dendritic cells to induce Th1 polarization

Abstract

[한글]수지상세포는 항원 특이적인 T 림프구에 의한 면역 반응을 유도할 수 있는 특별한 능력을 갖고 있어 종양의 면역세포치료 방법으로써 그 중요성이 부각되고 있다. 현재 전세계적으로 다양한 종양의 치료를 위해 수지상세포 백신을 이용한 임상시험이 진행 중이며, 치료의 일부에서 긍정적인 임상경과의 보고가 있지만 그 결과가 일정하지 않아, 종양의 면역 억제반응으로부터 자유롭고 기능이 탁월한 수지상 세포를 이용하는 방법의 표준화가 이루어지지 못한 실정이다. 본 연구는 기존의 수지상세포를 이용한 종양 백신이 제한적인 성공만을 거두고 있는 원인으로써 수지상세포의 배양과 제작에 있어서 수지상세포의 활성을 최대한 발휘하는 조건에 도달하지 못하고 있음을 판단하여, 건강한 성인의 말초 혈액에서부터 단핵구를 분리한 다음 임상적으로 적용이 가능한 다양한 성숙인자들의 조합들에 수지상세포를 노출하여 수지상세포의 분화 및 기능의 최적화를 위한 조건을 선별하고자 하였다. 이를 위해, 감염성 질환을 대변하는 toll like receptor의 리간드들 [polyinosinic : polycytidylic acid (polyI:C), lipoteichoic acid 및 peptidoglycan]과 활성화된 T 림프구에 의해 제공되는 활성인자 (CD40 리간드), interferon(IFN)-α 및 cytokine cocktail [tumor necrosis factor (TNF)-α, Interleukin (IL)-6, IL-1β, prostaglandin E2] 의 단독 또는 두 가지의 조합으로 수지상세포를 자극시키는 방법을 활용하여, 그 중에서 poly(I:C) 와 cytokine cocktail 의 조합이 수지상세포의 성숙을 유도하는데 탁월하다는 것을 밝혀냈다. 수지상세포의 활성은 유세포 분석, 수지상세포가 분비하는 사이토카인 (IL-12 와 IL-10)의 효소결합 면역 흡수법을 통한 정량 측정, 수지상세포의 타가 혼합 림프구 자극 능력 및 림프절로의 이동성으로 비교하였으며, 특히 cytokine cocktail과 poly(I:C)를 6시간의 간격을 두고 순차적으로 자극시킨 수지상세포에서 동시에 자극시킨 것보다 그 기능이 향상됨을 확인하였다. 또한 이러한 조건으로 배양된 수지상세포들은 그의 성숙을 저해하는 사이토카인인 IL-10을 포함시킨 배양조건에서 수지상세포의 형질을 유지하는데 우수했다. 이와 더불어, 이 조건에서 수지상세포는 T 림프구와의 공동배양을 통해 T 림프구로부터 상당량의 IFN-γ 분비를 유도하는 T helper type 1 세포성 면역반응을 보임으로써 최적화된 능력을 검증할 수 있었다. 이상의 결과는 백신으로서의 임상연구에 적용하기 위한 중요한 단계인 수지상세포의 체외 배양에서 그 기능을 최적화시키는데 효과적인 방법을 제시함에 본 연구의 의의를 둘 수 있다.

[영문]Dendritic cells (DCs) are uniquely potent in the induction of antigen-specific T cell responses, and therefore their application to therapeutic cancer vaccines has been studied with considerable interest. Despite the use of DC-based vaccination in many clinical cases, the clinical outcome was less than anticipated, suggesting the need to optimize DC vaccination including the functional optimization of in vitro generated DCs. Although the current "gold standard" protocol of DC maturation for clinical trials utilized inflammatory cytokine cocktail composed of tumor necrosis factor-α, interleukin (IL)-1β, IL-6 and prostaglandin E2, this cocktail fail to induce IL-12p70, a key factor for T helper type 1 (Th1) polarization. This study aims to examine effective combinations of stimulators for generating functionally competent mature DCs (mDCs). The functional capacity of DCs was performed in response to all possible pairwise combinations of several clinical grade stimuli: cytokine cocktail, peptidoglycan, lipoteichoic acid, polyinosinic : polycytidylic acid [poly(I:C)], interferon (IFN)-α and soluble CD40 ligand. When the maturation status of DCs was comprehensively analyzed by the immunophenotype, IL-12p70 production and T cell allostimulation, cytokine cocktail plus poly(I:C) was selected as a potent stimulator to enhance the function of mDCs. Mimicking the sequential exposure to maturation stimuli that occurs in vivo, cytokine cocktail and poly(I:C) were added to DCs at differing times and order. Interestingly, cytokine cocktail at 0 h plus poly(I:C) at 6 h (C0/P6) was the strongest stimuli for DC maturation as compared to simultaneous stimulation (C0/P0). These DCs (C0/P6) had high migratory capacity and phenotypic stability at the culture condition under IL-10 and displayed optimal characteristics to induce Th1 polarization, as assessed by T cell allostimulation and intracellular interferon (IFN)-γ/IL-4 staining. Moreover, sequentially stimulated DCs reduced IL-10 production compared to DCs stimulated with cytokine cocktail and poly(I:C) simultaneously, which was mediated by signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) modulation. In conclusion, the present study suggests that sequential maturation with C0/P6 is a powerful stimulator to optimize function of DCs in vitro and has value for future clinical application.