Paclitaxel sensitivity related genes in gastric cancer

Abstract

[한글]

암세포의 유사분열기 동안 미세소관의 해중합화 과정을 억제함으로써 세포사멸을 일으키는 항암제인 paclitaxel은 다양한 암종에서 사용되고 있다. Paclitaxel의 저항성은 넓은 범위에서 연구되어 왔지만, 그 메커니즘은 MDR1과 tumulin에 국한되어 왔다. 따라서 본 연구에서는 high-throughput 방법을 이용하여 새로운 paclitaxel 감수성 관련 유전자를 찾았고, 이 유전자들의 기능을 paclitaxel 감수성과 관련된 측면에서 증명하였다. 먼저 MTT-assay와 oligonucleotide microarray를 이용하여 78개 인간 암세포주의 항암제감수성과 유전자 발현 정도를 각각 구축하였다. 이 두 정보를 통합함으로써 paclitaxel 저항성, 민감성을 나타내는 집단 사이에서 발현의 차이를 보이는 paclitaxel 감수성 관련 유전자 군을 선별하였다. Leave-one-out cross-validation (LOOCV) 방법으로 내부 검증을 수행하였고, 위암세포주를 이용하여 만든 암조직의 항암제감수성을 support vector machine (SVM)으로 예측하였다. 선별된 유전자들의 위암세포주에서의 기능적 평가를 위해서 siRNA를 이용하여 유전자들의 발현을 억제시킨 뒤 세포 생존능력 분석, apoptosis 분석, 세포주기 분석을 수행하였다. 본 연구에서는 paclitaxel 감수성과 관련된 115개 유전자를 선별하였고, LOOCV는 93%의 높은 예측율을 보였다. SVM 결과에서도 선별된 유전자들은 100% 예측율을 나타냈고, 이 결과를 토대로 선별된 유전자들은 paclitaxel 항암요법에 있어서 예측인자가 될 수 있음을 보였다. Paclitaxel 저항성 위암세포주 (NCI-N87)와 민감성 위암세포주 (MKN-45), 그리고 이 세포주들로 만든 암조직에서 선별된 유전자들의 발현정도를 quantitative, semi-quantitative RT-PCR 기법을 이용하여 증명하였다. 선별된 유전자 중 LAMP2와 RARRES3에 대해서는 NCI-N87 세포주에서 기능적 연구를 수행하였다. 먼저 siRNA를 이용하여 유전자의 발현을 억제시킨 결과 두 유전자의 발현이 억제됨을 확인하였다. 이어서 수행한 세포 생존능력 분석, apoptosis 분석, 세포주기 분석 결과, 두 유전자의 발현 억제가 necrosis, 늦은 apoptosis, 세포주기의 G2/M기 억류 등을 통해서 paclitaxel의 감수성을 회복시킴을 보였다. 결론적으로 선별된 유전자들은 항암치료를 받지 않은 위암 환자에 있어서, paclitaxel 항암요법에 대한 예측인자가 될 수 있을 뿐만 아니라 paclitaxel의 항암제 민감인자가 될 수 있을 것으로 생각된다.

[영문]

Paclitaxel, a widely used anticancer drug, inhibits microtubule depolymerization during mitosis, which leads to cell death in various cancer types. Paclitaxel resistance has been widely studied, but the mechanism was confined to MDR1 and tubulin. Herein, we selected novel paclitaxel sensitivity related genes using a high-throughput method and validated their functions with respect to paclitaxel sensitivity. We constructed chemosensitivity and gene expression profiles for 78 human cancer cell lines using MTT-assays and oligonucleotide microarrays, respectively. Genes with differential expression between the resistant and sensitive groups were selected as paclitaxel sensitivity-related genes. Leave-one-out cross-validation (LOOCV) was performed for internal validation, and support vector machine (SVM) was used for in vivo chemosensitivity prediction with tumors derived from gastric cancer cell lines. For functional evaluation of selected genes in gastric cancer cell lines, gene silencing was conducted with siRNA followed by cell viability assays, apoptosis assays, and cell cycle arrest analysis with paclitaxel treatment. We selected 115 genes that were related to paclitaxel sensitivity, for which LOOCV predicted an accuracy of 93%. The SVM demonstrated a prediction accuracy of 100% for the selected genes and demonstrated that these selected genes could be predictive markers for paclitaxel chemotherapy. After confirming the expression of the selected genes by quantitative and semi-quantitative RT-PCR in resistant and sensitive gastric cancer cell lines (NCI-N87 and MKN-45, respectively) and in vivo tumor tissues derived from NCI-N87 and MKN-45, functional studies were performed with LAMP2 and RARRES3 in NCI-N87 cell line. Using siRNAs, we observed that the expression of these genes was repressed. Subsequent cell viability assays, apoptosis assays, and cell cycle arrest analysis revealed that knockdown of these two genes restored paclitaxel sensitivity by increasing necrosis, late apoptosis, and cell cycle arrest at the G2/M phase. In conclusion, the selected genes may act as not only predictive markers for paclitaxel chemotherapy, but also as chemo-sensitizers for paclitaxel in chemo-naive gastric cancer patients.