Phosphorylation of HMGB1 and its effect on the nucleocytoplasmic shuttling and secretion

Abstract

[한글]

High mobility group box 1 (HMGB1) 단백질은 내독소 혈증, 균혈증, 출혈성 쇼크 발생시 활성화된 단구(monocyte), 대식세포(macrophage), 자연살(NK) 세포에서 분비되어 전염증성(proinflammatory) 사이토카인과 같은 기능을 수행함으로써 세균 감염 및 염증성 질환의 병인기전에 관여한다. HMGB1은 2개의 DNA 결합 모티브 (HMG box A 및 B)와 산성을 띠는 꼬리 (acidic tail)를 갖는 구조이고 2개의 핵 국재화 시그널(nuclear localization signal, NLS)과 2개로 예상되는 핵 방출 시그널(nuclear export signal, NES)이 있다. 즉, 핵과 세포질 사이의 이동이 엄격하게 조절될 것으로 예상할 수 있으나 HMGB1의 세포 밖 분비기전은 아직까지 분명치 않다.

본 연구에서는 전염증성 사이토카인인 TNF-α, 내독소 그리고 포스파타제(phosphatase) 억제제인 okadaic acid(OA)를 RAW 264.7세포와 사람의 말초혈액 단구 (peripheral blood monocytes, PBMo) 에 처치하였을 경우 HMGB1의 serine 잔기가 인산화됨을 관찰하였고, 인산화된 HMGB1은 세포질에서 핵으로의 이동이 저해됨을 확인하였다.

HMGB1의 NLS 부위의 serine이 주요 인산화 부위이며 인산화가 일어나면 HMGB1의 핵 내 이동을 담당하는 karyopherin- 1 핵 유입 단백질과의 결합이 억제되어 핵 내 이동이 방해됨을 알 수 있었다. 그리고 NLS 부위의 serine 잔기들을 음전하를 띤 잔기들로 치환하였을 경우 인산화 상태와 유사하게 HMGB1의 핵 내 유입이 억제되는 현상을 관찰하였다. 이는 인산화에 의해 야기되는 HMGB1의 NLS부위에서의 전하의 변화가 핵 유입 단백질과의 결합을 저해할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 HMGB1의 인산화 상태가 세포 밖 방출을 야기하는 핵에서 세포질로의 이동을 촉진하고, 이러한 HMGB1의 인산화 조절이 HMGB1 분비 함께 HMGB1의 활성을 제어함에 있어 중요하다고 생각된다.

[영문]

The high mobility group box 1 (HMGB1) protein can be secreted by activated monocytes and macrophages, and functions as a late mediator of sepsis. HMGB1 contains two nuclear localization signals (NLSs) for nuclear transport, and acetylation of both NLSs of HMGB1 is involved in nuclear transport toward secretion. However, phosphorylation of HMGB1 and its relation to nuclear transport have not been shown. This study demonstrates that HMGB1 is phosphorylated and dynamically shuttled between cytoplasmic and nuclear compartments according to its phosphorylation state.

Phosphorylation of HMGB1 was detected by metabolic labeling and Western blot analysis after treatments with TNF-α and okadaic acid, a phosphatase inhibitor.

Hyperphosphorylated HMGB1 in RAW 264.7 and human monocytes was relocated to the cytoplasm. In a nuclear import assay, phosphorylated HMGB1 in the cytoplasm did not enter the nucleus. Serine residues of either or both NLSs of HMGB1 were mutated to glutamic acid to simulate a phosphorylated state and the binding of HMGB1 to karyopherin-α1, which was identified as the nuclear import protein for HMGB1 in this study, was examined. Substitution to glutamic acid in either NLSs decreased the binding with karyopherin-α1 by about 50%; however, substitution of both NLSs showed no binding, and HMGB1 was relocated to the cytoplasm and subsequently secreted. These data support the hypothesis that HMGB1 could be phosphorylated and that the direction of transport is regulated by phosphorylation of both NLS regions.