신생아기 저산소성-허혈성 뇌손상 동물 모델에서 신경세포 생성 유도 및 기능 회복

Abstract

[한글]

최근 성체 시기의 뇌에도 뇌실하 부위(subventricular zone; SVZ)에 신경 줄기/전구세포가 존재하며, epidermal growth factor (EGF)와 같은 세포증식 인자를 뇌실 내 투여시 이들 세포들의 증식을 활성화 시킬 수 있으며, 특히 대표적인 뇌 신경영양 인자인 brain-derived neurotrophic factor (BDNF)의 투여로 비 신경생성(non-neurogenic) 부위인 선조체(striatum)로도 신경세포 유입이 증가될 수 있다.이에 난치성 중추신경계 질환인 신생아기 저산소성-허혈성 뇌손상 동물 모델의 성체 시기에 신경영양 인자 및 세포증식 인자를 뇌실 내로 지속적으로 투여하는 재조합 유전자 단백질 치료를 통해 비 신경생성 부위인 선조체내 신경세포 생성 유도 및 이로 인한 기능적 효과를 확인하며, 향후 뇌성마비 및 뇌손상 환자에 대한 임상 적용의 가능성을 알아보고자 하였다.생후 7일의 CD-1(ICR) 쥐에서 편측(우측) 경동맥을 결찰하여 영구적인 허혈성 뇌손상을 유발한 후 8%의 저산소 통에서 1.5시간 동안 저산소 환경 하에서 저산소성 뇌손상을 유발하였다. 이후 생후 6주에 신경영양 인자인 BDNF (1 μg/ml)와 세포증식 인자인 EGF (1 μg/ml)를 Alzet 삼투압 펌프(osmotic pump)를 사용하여 2주 동안 우측 뇌실 내로 지속적으로 주입하였다. 즉, BDNF 투여군 및 EGF 투여군과 상기 인자 들을 조합하여 동일한 농도로 투여하는 병합 투여군으로 실험 대상군을 설정하였으며, 대조군에서는 phosphate buffered saline (PBS)을 동일한 방법으로 투여하였다.본 연구 결과, 수술 전 평가에서는 각 대상군 간에 유의한 차이를 보이지 않았으나, 수술 8주 후 고정 속력(48 rpm) 및 가속력(4∼80 rpm) rotarod 검사에서 BDNF 및 EGF 병합 투여군에서 평균 rotarod 지속 시간이 PBS 대조군에 비하여 유의하게 증가된 소견을 보였다(p<0.05). 또한 BDNF 및 EGF 단독 투여군도 각각 PBS 대조군에 비하여 rotarod 지속 시간이 증가된 경향을 보였다. 그러나 편측 뇌병변 및 편마비 증상에 의한 비대칭성 여부를 평가하기 위해 시행한 사다리 보행(ladder walking) 검사 및 상지 사용 비대칭성 검사(cylinder 검사)에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.면역조직화학 검사 상, 선조체 내에서 관찰된 세포증식 표식자인 BrdU 양성 세포(/mm3)는 BDNF 투여군, EGF 투여군 및 병합 투여군에서 PBS 대조군에 비해 유의하게 증가되었으며(p<0.05), 선조체 내에서 BrdU와 신경세포 표식자인 βIII-tubulin의 동반 염색된 세포(/mm3)도 BDNF 및 EGF 병합 투여군에서 다른 군에 비해 통계학적으로 유의하게 증가된 소견을 확인하였다(p<0.05).결론적으로 신생아기 저산소성-허혈성 뇌손상 동물 모델의 성체 시기에 BDNF 및 EGF의 뇌실 내 투여에 의한 선조체내 신경세포 생성 유도는 rotarod 지속 시간이 증가되는 운동기능 회복 소견을 보이므로, 상기 방법은 향후 뇌성마비 질환을 치료할 수 있는 유용한 방법으로 생각되며, 뇌졸중, 파킨슨 병, 헌팅톤 병 등과 같은 난치성 중추신경계 질환의 치료에도 응용될 수 있을 것으로 사료된다.

[영문]Intraventricular administration of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and epidermal growth factor (EGF) is able to activate neural stem/progenitor cells in subventricular zone, and to induce neuronal recruitment in the adult neostriatum from endogenous subependymal progenitor cells.This study investigated whether recombinant genetic protein therapy through continuous infusion of mitogenic factor and neurotrophic factor might induce neurogenesis, even in the striatum, a non-neurogenic region, and functional recovery in the adult mouse model with neonatal hypoxic-ischemic brain injury and the possibility of clinical application for the patients with cerebral palsy and brain injury in the future.Postnatal day 7 (P7) CD-1 (ICR) mice were subjected to unilateral right common carotid artery ligation to induce permanent ischemic brain injury. This procedure was followed by exposure to 8% oxygen for 1.5 hour which made hypoxic brain damage. At 6 weeks after birth, the mice with hypoxic-ischemic brain injury were treated with intraventricular administration of brain-derived neurotrophic factor (BDNF; 1 μg/ml) and/or epidermal growth factor (EGF; 1 μg/ml) for 2 weeks using Alzet osmotic pump connected to a brain infusion kit. Then, the animals were were randomly assigned to the following 4 groups without bias; BDNF-, EGF-, combination of BDNF and EGF (BDNF/EGF)-, and PBS-treated groups.In this result, the mice treated with BDNF/EGF showed significantly longer mean rotarod latency in both constant speed (48 rpm) and accelerating speed (4∼80 rpm) than the PBS controls 8 weeks after operation (p<0.05), although there were no difference of rotarod performance among all the groups at pre-operative evaluation. In addition, mice treated with BDNF and EGF alone showed better rotarod performance than the PBS controls respectively even though it was not statistically significant. However, functional testing - such as ladder walking test and cylinder test to evaluate limb-use asymmetry derived from brain damage of unilateral hemisphere and consequent hemiplegia - did not show any significant difference among the groups.Immunohistochemistrical study showed that intraventricular co-delivery of BDNF and EGF in vivo significantly increased the number of BrdU+ cells (/mm3), and the newly generated neurons double-stained with BrdU and βIII-tubulin (/mm3) in the striata of the hypoxic-ischemic injured brain, compared to the other groups (p<0.05).In conclusion, intraventricular administration with BDNF in conjuction with EGF induced striatal neurogenesis, and promoted motor functional recovery in the adult mice with neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Therefore, this treatment might be a promising therapeutic strategy for the repair of damaged striatum in cerebral palsy, potentially extending the use for recombinant genetic protein therapy in a variety of intractable neurological diseases such as stroke, Parkinson’s disease, and Huntington’s disease.