Toll like receptor 4 initiates an innate immune response to lipopolysacccharide in human conjunctival epithelial cells

Abstract

[한글]

결막상피는 선천면역체계의 한 구성원으로써 침입한 병균에 대한 일차방어선으로 작용한다. 침입한 병균에 대한 선천면역은 Toll-like receptor (TLRs)에 의해 시작되며, 그 중 TLR4은 그람 음성 세균의 구성성분인 lipopolysaccharide (LPS)를 인지하여, 염증성 cytokine을 생성하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 중층으로 배양된 결막상피세포에서 TLR4의 ligand가 NF-kappa B의 활성화를 통하여 염증성 cytokine을 생성할 수 있는지 알아보기로 하였다.중층으로 배양한 결막상피세포를 다양한 농도의 LPS로 처리하였다. 우선 결막상피세포에 TLR4가 존재하는지 RT-PCR과 FACS로 확인하였다. 선천면역반응의 측정은 IL-6 및 IL-8유전자 발현과 상층액에서 IL-6 및 IL-8생성으로 측정하였다. LPS 처리 후 NF-kappa B 가 활성화되는지 알아보기 위하여 luciferase reporter assay를 시행하였다.중층으로 분화시킨 인체결막상피세포에서 TLR4 유전자 발현이 RT-PCR로 확인되었으며, FACS 시행 결과 세포표면 및 세포내에 TLR4가 존재함이 밝혀졌다. LPS를 농도별로 처리한 결과, NF-kappa B 가 활성화되었으며, IL-6 및 IL-8 의 발현 및 생성이 증가하였다. TLR4와 TRAF6 활성화를 억제한 결과 결막상피세포에서 LPS에 의한 염증 반응의 유도가 억제되었다. 또한 LPS는 결막상피세포에서 TLR4의 발현을 증가시키지는 않았다. 본 연구결과는 인체결막상피세포 표면에 TLR4가 존재하며, 결막상피세포가 침입한 그람음성세균에 대하여 TLR4에 의해 매개되는 선천면역을 유도하여 안구표면의 염증성 환경을 이루는 데 중요한 역할을 함을 보여준다.

[영문]Conjunctival epithelial cells serve as a first line of defense against pathogens presented to the innate immune system. The inflammatory response to Gram-negative bacteria is initiated by Toll-like receptor 4 (TLR4). The purpose of our study was to investigate whether a TLR4 ligand induces production of inflammatory cytokines in human conjunctival epithelial cells (HCECs) through nuclear factor kappa-B (NF-kB).HCECs were stimulated with various concentrations of lipopolysaccharide (LPS). HCECs were evaluated for TLR4 expression by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and flow cytometric analysis. The innate immune response was quantified by measuring expression of the inflammatory cytokines IL-6 and IL-8. Functional NF-κB activation was examined using a luciferase reporter assay.Expression of TLR4-specific mRNA as well as its corresponding protein was observed both intracellularly and on the cell surface of HCECs. Incubation of HCECs with LPS led to activation of the NF-κB transcription factor and secretion of IL-6 and IL-8 in a dose dependent manner. Blockade of TLR4 and TRAF6 activity abolished induction of the inflammatory response to LPS in HCECs. LPS did not induce the expression of TLR4 in HCECs. This study demonstrated that surface expression of TLR4 in human conjunctival epithelial cells was able to elicit a TLR4-mediated innate immune response and contribute to an inflammatory environment on the ocular surface.