Role of angiotensin II Type 2 receptor and VEGF-D in cerulein-induced inflammation of pancreatic acinar cells

Abstract

[한글]

급성 췌장염은 최근의 많은 기초적, 임상적 연구에도 불구하고 아직까지도 높은 사망률을 보이며 정확한 병리기전은 잘 알려져 있지 않은 실정이다. Cholecystokinin 유도체인 cerulein은 빠른 시간에 인체 급성 췌장염에서 볼 수 있는 췌장효소의 과잉 분비를 유도하여, 급성 췌장염 징후 현상들(췌장의 부종, 선세포의 vacuolization, 혈청 amylase와 lipase의 증가, 출혈 및 조직의 괴사)을 나타내므로, cerulein 유도 급성 췌장염 모델은 급성췌장염의 모델로써 널리 사용되고 있다.본 연구에서는 cerulein의 처치에 의하여 급성 췌장염을 유발시킨 췌장선세포주인 AR42J 세포를 이용하여 췌장염 유발에 의한 angiotensin II type 2 수용체 활성화의 기전에 대하여 VEGF-D의 상호관련성을 규명하여 급성 췌장염 유발에 대한 angiotensin II type 2 수용체 활성에 대한 새로운 기전을 규명하고자 하였다. 췌장염의 발생 기전에 대한 예비실험으로서 cerulein을 처치한 AR42J 세포주에서 막단백질을 분리한 후 2D gel 전기영동법을 사용하여 이들 단백질들을 분석하여 본 결과 여러 세포막의 단백질의 발현량의 변화를 관찰하였는데, 이 중 VEGF-D 단백질이 증가함을 보였다. 다른 세포의 염증관련 신호전달체계에서 혈관내피세포성장인자로 알려진 이 단백질은 angiogenesis에서의 성장인자 및 ERK1/2 활성화에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 최근 연구 결과, 또 다른 rennin-angiotensin 계의 요소인 angiotensin II type 2 수용체가 췌장에서의 존재가 확인되어 이 단백질도 cerulein 유도 췌장염 유발의 신호전달체계에 관여하고 있음을 시사하고 있다. 또한 췌장염은 angiotensin II type 2 수용체의 활성화에 의한 MAP kinase인 ERK1/2 활성에 의하여 유발된다고 알려졌다. 게다가 VEGF-D가 이 angiotensin II type 2 수용체와 단백질 결합을 통하여 염증을 유발한다는 보고는 있지만, 염증 초기 단계의 췌장염에서의 조절기전에 대해서 명확한 결과를 제시하지 못하고 있어, 그 체계적인 연구가 아직까지 미미한 실정이다.본 실험 결과, cytokine의 발현은 ERK1/2 또는 MEK1의 길항제와 마찬가지로 IκB 변종, RasN-17 또는 TAM67 같은 dominant negative 유전자에 의하여 억제됨을 보아, cerulein 유도 염증 유발에는 NF-κB, AP-1와 ERK1/2가 관여함을 알 수 있다. 또한, cerulein에 의한 NF-κB and AP-1에 대한 DNA 결합 활성도는 ERK1/2의 길항제에 의하여 억제됨을 보아, NF-κB and AP-1에 대한 DNA 결합 활성도는 ERK에 의한 신호전달체계에 의해 매개됨을 시사한다.Cerulein에 의하여, 세포막에서의 VEGF-D의 양적 증가와, VEGF-D와 angiotensin II type 2 수용체의 상호간 단백결합이 이루짐을 관찰할 수 있었다. VEGF-D의 antisense-oligodeoxynucleotide을 세포내로 transfection 시키어 VEGF-D의 세포막 이동을 억제시키면 NF-κB and AP-1에 대한 DNA 결합 활성도와, MAP kinases의 인산화, IL-6 발현이 억제되는 것으로 보아, VEGF-D의 cerulein에 의한 세포막 이동이 중요한 역할을 할 것으로 보인다. 또한, cerulein으로 유도된 cytokine 발현은 VEGF-D 수용체 억제제가 아닌 angiotensin II type 2 수용체의 억제제에 의하여 감소되었음을 보였다. 결론적으로 지금까지의 췌장염 병인 연구의 결과에 의하면 cerulein의 자극으로 cholecystokinin 수용체의 활성화를 통하여 친염증성 cytokine의 발현하는 신호전달체계 외에, cerulein에 의한 VEGF-D와 세포막의 angiotensin II type 2 수용체의 결합을 통하여 친염증성 cytokine의 발현으로 이루어지는 새로운 신호전달체계가 존재한다고 생각된다.

[영문]Cerulein-induced pancreatitis model is similar to human acute edematous pancreatitis. Their common characteristics include dysregulation of the digestive enzyme production, aberrant cytoplasmic vacuolization, death of acinar cells, edema formation, and infiltration of inflammatory cells into the pancreas.The present study was designed to elucidate the role(s) of VEGF-D and angiotensin II type 2 receptor in inflammatory signaling in cerulein-stimulated rat pancreatic AR42J cells. Stimulation of AR42J cells by cerulein caused differential expression of several membrane proteins. Among these proteins, level of VEGF-D was increased by cerulein treatment. Angiotensin II type 2 receptor, another renin-angiotensin system component, is localized and associated with cerulein-induced inflammation in pancreatic acinar cells. In this study, it was shown that angiotensin II type 2 receptor interacts with VEGF-D.Cytokine expression was inhibited by treatment with ERK1/2 or MEK1 antagonists as well as by transfection with dominant negative genes such as IκB mutant, RasN-17 (for Ras) or TAM67 (for c-Jun) in cerulein-stimulated AR42J cells. This indicates that NF-κB, AP-1 and ERK1/2 are involved in cerulein-induced inflammation. Furthermore, cerulein-induced activation of NF-κB and AP-1 was inhibited by antagonist of ERK1/2. This suggests that activation of NF-κB as well as that of AP-1 is mediated by ERK signaling pathways.Cerulein induced translocation of VEGF-D to the cell surface, and increased its interaction with angiotensin II type 2 receptor. Antisense-oligonucleotide for VEGF-D suppressed activation of NF-κB and AP-1 as well as IL-6 expression in cerulein-stimulated AR42J cells. This demonstrates that VEGF-D activates expression of cytokines through activation of AP-1 and NF-κB. Additionally, expression of cytokines was inhibited by angiotensin II type 2 receptor antagonist but not by VEGF receptor antagonist in cerulein-stimulated AR42J cells. In conclusion, VEGF-D mediates the inflammatory signaling of pancreatic acinar cells through interaction with angiotensin II type 2 receptor.