FR167653, a p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) inhibitor, ameliorates fibronectin and type IV glomeruli

Abstract

[한글]

배 경: 당뇨병성 신병증은 병리학적으로 사구체 비후와 세포외 기질의 축적이 특징적인 소견으로, 당뇨 조건 하에서 p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 경로의 활성화를 통하여 fibronectin과 제 4형 collagen의 발현이 증가하는 것으로 보고되고 있다. FR167653 {1-[7-(4-fluorophenyl)-1,2,3,4-tetrahydro-8(4- pyridylpyrazolo(5,1-c)(1,2,4)triazin-2-yl]-2-phenylethanedion sulfate monohydrate}은 interleukin-1과 tumor necrosis factor- 생성을 억제시키는 효과를 가진 약제로, p38 MAPK 경로의 억제를 통한 항염증 작용으로 인하여 만성 이식 신병증, 반월상 사구체신염, 그리고 자가면역 신질환 등에서 신손상을 감소시켰다는 보고는 있으나, 당뇨병성 신병증에서의 효과에 대한 연구는 현재까지 전무한 실정이다. 이에 본 연구에서는 당뇨 백서를 대상으로 p38 MAPK 억제제인 FR167653가 24시간 뇨알부민 배설량과 사구체 내 fibronectin과 제 4형 collagen의 발현에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.방 법: 32마리의 Sprague-Dawley 백서를 대조군 (16마리)과 streptozotocin을 복강내로 투여하여 당뇨를 유발시킨 당뇨군 (16마리)으로 나누어, 각 군에서 8마리씩은 p38 MAPK 억제제인 FR167653을 1일 10 mg/kg 용량으로 3개월간 매일 경구 투여하였으며 (C+FR, DM+FR), 나머지 8마리씩은 위약을 투여하였다 (C, DM). 당뇨 유발 3개월 후 24시간 소변을 채취하여 알부민 배설량을 ELISA로 측정하였으며, 희생시킨 후 sieve를 이용하여 분리한 사구체를 실험에 사용하였다. 사구체 내 p38 MAPK와 p38 MAPK에 의하여 조절되는 전사인자인 c-AMP-responsive element binding protein (CREB)의 단백 발현 및 활성도는 Western blot으로, fibronectin과 제 4형 collagen mRNA와 단백 발현은 각각 real time-PCR과 Western blot으로 분석하였다. 또한 신장 조직을 이용하여 fibronectin에 대한 면역조직화학 염색과 제 4형 collagen에 대한 면역형광 염색도 시행하였다.결 과: 당뇨 유발 3개월 후 체중에 대한 신장 무게비는 DM군에서 1.54 0.13%로, C군의 0.53 0.04%와 C+FR군의 0.59 0.06%에 비하여 유의하게 증가되었으며, 이러한 증가는 FR167653투여로 의미있게 억제되었다 (p<0.01). 또한, FR167653은 DM군에서 의의있게 증가된 24시간 뇨알부민 배설량을 유의하게 감소시켰다 (C, 0.40 0.06 mg/day; DM, 1.99 0.22 mg/day; DM+FR, 1.04±0.19 mg/day; p<0.05). Phospho-specific p38 MAPK와 phospho-specific CREB을 이용한 Western blot 분석상 p38 MAPK와 CREB의 활성도는 C군에 비하여 DM군에서 각각 1.8배 (p<0.05), 2.3배 증가되었으며 (p<0.01), 이러한 증가는 FR167653 투여로 각각 77.8% (P<0.05), 63.4% (p<0.01) 억제되었다. 반면에 총 p38 MAPK와 총 CREB의 단백 발현은 네 군 사이에 의미있는 차이가 없었다. Fibronectin과 제 4형 collagen의 mRNA 발현은 C군에 비하여 DM군에서 각각 2.1배, 1.9배 증가되었으며, FR167653은 DM군에서 증가된 fibronectin과 제 4형 collagen의 mRNA 발현을 의의있게 억제시켰다. Western blot와 신조직 염색으로 분석한 fibronectin과 제 4형 collagen의 단백 발현도 mRNA 발현 양상과 유사하였다.결 론: 이상의 결과로, p38 MAPK 억제제가 당뇨병성 신병증의 발생 예방에 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다.

[영문]Background. Diabetic nephropathy is characterized by glomerular hypertrophy and ECM accumulation, and the p38 MAPK pathway is known to be activated in diabetic glomeruli, leading to an increase in fibronectin and type IV collagen expression. This study was undertaken to investigate the effect of a p38 MAPK inhibitor, FR167653, on urinary albumin excretion and on glomerular fibronectin and type IV collagen expression in diabetic rats.Methods. Thirty-two Sprague-Dawley rats were injected with diluent (C, N=16) or streptozotocin intraperitoneally (DM, N=16). Eight rats from each group were treated with 10 mg/kg/day FR167653 (C+FR, DM+FR) for 3 months. At the time of sacrifice, 24-hour urinary albumin excretion was determined by ELISA. Glomerular p38 MAPK and c-AMP-responsive element binding protein (CREB) activities were determined by Western blot with phospho-specific antibodies, and glomerular fibronectin and type IV collagen mRNA and protein expression were determined by real-time PCR and Western blot, respectively, with sieved glomeruli.Results. The ratio of kidney weight to body weight (KW/BW) in DM (1.54±0.13%) was significantly higher than that in C rats (0.53±0.04%; p<0.01), and the increase in KW/BW was ameliorated by FR167653 administration (0.84±0.07%; p<0.01). FR167653 also significantly inhibited the increase in albuminuria in DM rats (C, 0.40±0.06 mg/day; C+FR, 0.41±0.07; DM, 1.99±0.22 mg/day; DM+FR, 1.04±0.19 mg/day; p<0.05). Glomerular p38 MAPK and CREB activities were significantly increased in 3-month DM rats compared to C rats, and FR167653 significantly abrogated the increase in p38 MAPK and CREB activities in DM glomeruli (p<0.05). Fibronectin and type IV collagen mRNA expression were significantly increased in DM glomeruli and these increases were inhibited by 86.8% and 79.9%, respectively, with FR167653 treatment (p<0.05). FR167653 also ameliorated the increases in fibronectin and type IV collagen protein expression in DM glomeruli (p<0.05).Conclusions. These findings suggest that p38 MAPK could be a potential target for preventing nephropathy in diabetes.