Regulation of natural cytotoxicity receptor (NCR) expression on NK cells

Abstract

[한글]

자연살 세포(Natural Killer cells; NK 세포)는 종양세포 및 바이러스에 감염된 숙주세포를 제거하는 기능을 수행하며 부적절한 골수 이식을 거부하고 수상돌기세포를 통해서 T 세포의 면역반응을 조절하는 등 생체 내 면역계의 방어 기작의 제 1선에서 작용하는 매우 중요한 행동세포이다. 자연살 세포는 표면에 활성화 수용체(activating receptor)와 억제 수용체(inhibitory receptor)로 구분되는 여러 수용체들을 발현하고 있는데, 활성화 수용체 중에서도 자연 세포독성 수용체(Natural Cytotoxicity Receptors; NCRs)가 자연살 세포의 세포독성을 매개하는 주된 수용체이다. NKp46 (NCR1), NKp44 (NCR2) 그리고 NKp30 (NCR3)으로 구성되는 이 자연 세포독성 수용체들은 자연살 세포에서만 발현되고 그 표면 밀집도는 자연살 세포의 세포독성과 직접적으로 연관된다.본 연구는 자연살 세포에서의 자연 세포독성 수용체의 발현에 영향을 미치는 요인을 찾고 그 요소들이 어떻게 수용체의 발현을 조절하는지 알아보고자 하였다. Jurkat T 세포주를 사용하여 자연 세포독성 수용체를 발현하는 세포주를 구축하여 PMA 자극에 의해 변화하는 수용체의 발현을 유세포 분석과 RT-PCR과 immunoblotting으로 확인하였다. PMA에 의해서 NKp30과 NKp46의 발현이 8시간 정도까지 증가하다가 점차적으로 줄어들었으며 mRNA 양에서는 별 다른 변화를 관찰 할 수 없었다. 그에 비해 이들 자연 세포독성 수용체의 총 단백질량은 표면 발현과 비슷한 경향을 보였고 이러한 현상에 NKp46의 288번 serine이 중요한 역할을 하고 있음을 밝혀내었다.실제 자연살 세포에서의 자연 세포독성 수용체 발현에 영향을 미치는 인자들을 찾아내기 위해 기존에 면역계를 활성화 시킨다고 알려져 있던 여러 cytokine들을 탐색해 보았으나 크게 영향을 미치는 요소를 찾지 못했고, MEK 억제제인 PD98059, calpain 억제제인 PD150606과 proteosome 억제제인 Lactacystin도 자연 세포독성 수용체의 발현에 별 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. PMA 자극에 의해서 실제 자연살 세포에서는 NKp46의 발현이 다소 줄어들었다. PMA가 대표적인 PKC 활성제이므로 PKC 억제제가 자연 세포독성 수용체의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. 대부분의 PKC 억제제가 수용체의 발현에 아무런 영향을 미치지 못했는데, PKC α, β, γ, δ와 ζ를 억제하는 Gö6983에 의해서 NKp30과 NKp46의 발현이 현저히 증가하였다. Gö6983은 NKp30과 NKp46의 발현을 transcriptional level에서 조절함을 확인하였고 이렇게 증가된 수용체의 발현이 HepG2, Hep3B와 HeLa 암 세포주에 대한 자연살 세포의 세포독성의 증가에까지 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.결론적으로, PMA에 의해서 다소 감소하고 Gö6983에 의해서 크게 증가하는 자연 세포독성 수용체의 발현이 자연살 세포의 세포독성을 조절하고, 따라서 이들 약물은 생체 내 면역계 활성에도 영향을 미칠 수 있을 것이라 사료된다.

[영문]A number of surface receptors expressed on NK cells are related to the regulation of NK cell activity and characterized by either inhibitory or activating properties. Activating receptors usually have short cytoplasmic tails and transduce signals by associating with molecules containing Immunoreceptor Tyrosine-based Activating Motifs (ITAM). Natural cytotoxicity receptors (NCRs) are one major family of activating receptors involved in NK cytotoxicity, and are found only on NK cells. The three family members are NKp46 (NCR1), NKp44 (NCR2) and NKp30 (NCR3). Their surface density might vary with the activation state of NK cells, and the density may directly correlate with their natural cytotoxicity.In this study, we investigated the regulation of NCR expression on NK cells and the factors which affect it. We produced stable cell lines expressing full-length NCRs and investigated the change in expression after PMA treatment using flow cytometry, RT-PCR and immunoblotting methods. Expression of NKp30 and NKp46 on Jurkat T cell transfectants appeared to increase by PMA treatment until 8 hr after PMA treatment, but gradually decreased afterward to less than pre-treatment levels. Parallel to surface expression of NCRs, total NCR protein expression also appeared to fluctuate after PMA treatment, but expression of mRNA transcripts was not significantly affected. Experiments with mutant NCR-expressing stable cell lines demonstrated that 288Ser might be critical for NKp46 expression.In primary NK cells, most cytokines such as IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IFN-α1 and IFN-α2b did not appear to significantly alter NCR expression. PD98059, PD150606 and Lactacystin also did not induce any notable changes, suggesting that the MAP kinase and proteosome pathways might not be involved in the regulation of NCR expression. Interestingly, however, PMA slightly down-regulated NKp46 expression on primary NK cells. PMA is a well-known PKC activator. Furthermore, although other PKC inhibitors did not induce or suppress NCR expression, Gö6983, an inhibitor of PKC α, β, γ, δ and ζ, induced a remarkable increase of NCR expression on NK cells. Finally, we show that up-regulation of NCR on NK cells by Gö6983 caused an increase in NK cytotoxicity against hepatocellular carcinoma cell lines (HCCs) and HeLa presumably by increasing granule release.In conclusion, NCR expression is down-regulated by PMA, a PKC activator, and upregulated by Gö6983, a PKC inhibitor. As a consequence, NK cytotoxicity against HCCs and HeLa appeared to greatly increase after Gö6983 treatment, but slightly decrease after PMA treatment. This suggests that a specific PKC inhibitor, such as Gö6983, could be utilized to enhance NK cytotoxicity and consequently increase host tumor immunity by upregulation of NCR expression.