The implications of the MRN (hMRE11-hRAD50-NBS1) complex aberration in the colon carcinoma progression

Abstract

[한글]대장암의 일부 유형중 DNA mismatch repair (MMR)과정의 결함을 가진 암(MMR-deficient tumor)에서, hRAD50 유전자의 체이동 돌연변이 및 돌연변이hMRE11 접합 변이 형성이 종종 발견된다. hRAD50 및 hMRE11 단백질은 NBS1 단백질과 함께 복합체를 형성하며, DNA 이중나선 손상(DSB; double strand break) 복구의 두가지 기작인 상동성 재조합(homologous recombination)과 비상동성 결합 (nonhomologous end-joining (NHEJ))에 관여한다. MMR 결함(MMR-deficient) 암 세포주 중에 hRAD50과 hMRE11 유전자의 기능을 밝혀보고자, 대장암 세포주7 MMR-deficient type 7예와MMR-proficient type 5예를 이용하여 hRAD50과 hMRE11 발현 정도를 분석하였고, 기능적으로 NHEJ 활성을 측정하였다. hRAD50의 체이동 돌연변이는 MMR-deficient type 7예중 5예에서 발견되었고, 그 돌연변이에 따라 전사체 및 단백질 발현양이 감소하였다. 돌연변이 hMRE11 접합 변이는 MMR-deficient type 7예에서 모두 발견되었고, 그 중 4예에서 hMRE11 발현양이 감소되는 것을 확인하였다. hRAD50과 hMRE11의 감소된 발현양이 보이는MMR-deficient 암 세포주는 γ-irradiation에 더 민감하게 반응하였고, 또한 기능적으로 손상된 NHEJ 활성을 보였다. NHEJ 손상은small interference RNA에 의해 hRAD50 와 hMRE11 발현 저해 후에도 동일하게 유도되었다. 이러한 결과는 MMR-deficient 세포주에서 hRAD50과 hMRE11의 돌연변이는 NHEJ 결함에 연관되어, 암이 진행되는 동안 염색체 변이를 초래할 것으로 예상되었다.이와 함께 대장암 진행에 관련된 유전자 발현 정도를 분석하였다. 암 진행에서 전이 중요성은 널리 알려져있음에도 불구하고 그에 대한 분자적 기작은 알려져 있지 않다. 따라서 동일 환자의 원발암과 전이암의 유전자 발현 차이를 밝혀보고자, 12명의 환자의 세쌍의 조직(원발 대장암, 간 전이 대장암, 정상 점막) 12 세트를 가지고 19K human oligonucleotide microarray를 이용하여 유전자 발현 정도를 분석하였다. 총 36 microarray 실험으로 unsupervised hierarchical clustering, MDS( multi-dimensional scaling)을 통해 분석한 결과, 원발 대장암과 전이암에서 유전자 발현 차이를 보이는 경향성을 발견하였다. 따라서 supervised hierarchical clustering을 통해 80개의 차이나는 유전자를 밝혔고, 추가적으로 폐로 전이된 조직을 이용한 시험군 3예를 이용하여 분석한 결과, 이 80개 유전자로 원발암군과 전이암군을 구별할 수 있음을 다시 확인하였다. 결론적으로 대장암은 진행에 따라 새로이 축적되는 유전 변화의 종류에 의해 새로운 유전적 특성이 존재할 뿐 아니라, 이러한 유전 변화는 축적되어 진행되는 동안 원발암과 전이암 사이에 차이가 나는 유전 변화가 존재하게 되는 것으로 사료된다.

[영문]Both the hRAD50 and hMRE11 proteins form a heterotrimer with the NBS1, and this heterotrimer is involved in the double strand DNA break repair by homologous recombination and nonhomologous end-joining (NHEJ). Frameshift mutations of coding mononucleotide repeat of the hRAD50 gene and formation of the mutant hMRE11 splicing variant are frequent events in those tumors with mismatch repair (MMR) deficiency. In order to clarify the role of hRAD50 and hMRE11 gene alterations in MMR-deficient tumors, the expression of the hRAD50 and hMRE11 proteins were analyzed and NHEJ was evaluated in the 7 MMR-deficient and 5 MMR-proficient colon cancer cell lines. Frameshift mutations of the hRAD50 gene were found in 5 of 7 MMR-deficient cell lines, and these were directly related to the decreased expression of hRAD50 mRNA and protein. The hMRE11 splicing variant was found in all of the 7 MMR-deficient cell lines, and this was related to the decreased hMRE11 expression in 4 of the 7 MMR-deficient cell lines. MMR-deficient cell lines with decreased hRAD50 and hMRE11 expressions were more sensitive to γ-irradiation, and these cell lines showed an impaired NHEJ. These findings were confirmed by the induction of NHEJ impairment through the knockdown of hRAD50 and hMRE11 by small interference RNA. These findings suggest that mutations of hRAD50 and hMRE11 genes in MMR-deficient tumors are related to the defects in NHEJ, and this may lead to chromosomal changes during the progression of tumor.Despite the overwhelming clinical significance of metastasis related tumor progression, the cellular and molecular mechanisms involved are largely unknown. In order to define significant differences between primary colon carcinomas and their metastases, gene expression profiles of 12 sets of triple paired tissues (matched normal colon mucosae, primary colon carcinomas, and liver metastatic colon carcinomas) were analyzed using 19K human oligonucleotide microarrays. A total of 36 microarray experiments were analyzed by unsupervised multi-dimensional scaling (MDS). It was found that separable tendency could be classified into the primary and metastatic colon carcinomas by MDS. In supervised hierarchical clustering, 80 genes that were differentially expressed between paired primary and metastatic colon carcinomas were identified. The 80 identified genes also successfully distinguished three validation sets of primary and lung metastatic colon carcinomas. To confirm the validation of microarray data, RT-PCR and immunohistochemistry were performed. It was found that, in nearly half of the analyzed metastases, a specific set of genes was identified by which the metastasis from the corresponding primary tumor could be distinguished. It might suggest that a more accurate model of metastatic potential is based on a global tumor expression pattern along with appearance of distinct metastatic variants. This molecular profiling may be useful for the early detection of metastatic colon carcinomas during tumor progression.