Neurite Growth Regulation by Artemin in DRG Neuronal Cells

Abstract

[한글]신경돌기의 생성은 신경계에서 신경세포가 기능을 하는데 있어서 중요한 과정이며, 신경세포 주변의 외부환경 요소들은 이러한 신경돌기 생성에 영향을 끼친다. 이와 같은 외부환경 요소 중 하나인 Glialcell line Derived Neurotrophic Factor (GDNF)는 세포의 발달과 성장에 대해 여러 가지 능력을 가지고 있다. Artemin은 GDNF, neurturin, persephin을 포함한 GDNF 계열의 리간드 중 하나이다. 이 리간드들은 GFRα 및 RET tyrosine kinase와 복합화를 이루고, RET의 kinase 부위가 인산화 되면서 많은 세포 내 신호전달과정을 자극한다. Extracellular ligand Response Kinase 1/2 (ERK1/2), Src Family Kinase (SFK) 및 Phosphatidyl Inositol 3-Kinase (PI3-K)는 RET에 의해 자극 받고 더욱이 신경돌기 성장과 관련되어 연구 되어져왔다. 신호전달 과정 중 SFK와 유도 단백질 Nck는 세포 내 신호전달에서 기능을 하는 SH2/3 부위를 지니고 있다. 특별하게 SH3 부위는 Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (WASP), WASP interacting protein (WIP), Arp 2/3 등을 포함한 기능성 단백질과 결합하고, 이것들은 신경골격 단백질들과의 결합 및 actin 중합화 과정 중 말단부위에서 역할을 하여 신경돌기 성장을 조절한다.이에 본 연구에서 artemin이 신경돌기 성장에 영향을 주는지 알아보고 이 과정 중 신호전달 체계와의 연관성을 조사하였다. 또한, 신호체계에서의 관련 단백질을 검출해내는 과정을 수행하였다. 우선, 신경돌기의 길이 측정을 통해 artemin은 척수후근 신경절 세포의 신경돌기 성장과 actin 중합화를 자극함을 확인할 수 있었고 이에 더해 소포체 형성의 증가가 발견되었다. RET과 Src은 세포내에서 artemin에의해 활성화되고 있음을 면역 염색을 통하여 확인하였다. Artemin에 의한 신경돌기 성장과 연관된 세포내 신호전달을 알아보기 위하여 신호전달 억제물질을 사용하였고, 그 결과 ERK1/2와 SFK는 artemin에 의한 신경돌기 성장과 관련되어 있을 것이라 생각된다. 신호전달 과정에서 Nck와 SFK의 SH3 부위는 세포내 신호전달 물질을 포함한 기능적 물질들과 연결될 수 있는데 이에 연결되는 단백질을 찾기 위하여 GST-pull down과 2D proteomics 방법을 사용하였고, 이 과정에서 세포 골격 단백질과 아직 명명되지 않은 단백질을 포함한 몇몇 단백질들이 검출되었다.결론적으로 artemin은 RET tyrosine kinase와 연결되어 척수후근 신경절 세포에서 신경돌기의 성장을 자극하고, 이는 신경돌기 성장과 연관된 세포내 신호전달 체계를 자극하는 것으로 생각된다. 이렇게 artemin에 의해 자극된 신호전달 체계 중 ERK1/2와 SFK는 신경돌기 성장과 연관이 있을 것이라 추정되고, 이 과정에서 세포 골격 단백질을 포함한 몇몇 단백질들은 SH3 부위에 결합함을 알 수 있었다.

[영문]Neuritogenesis is a significant process in neuronal cells. Extra environments significantly affect neuritogenesis. Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) shows various effects on cell development and growth. Artemin is one of the GDNF family ligands (GFLs) containing GDNF, neurturin, and persephin. GFLs are bound to GFRα and RET tyrosine kinase, and stimulate many intracellular signal transduction pathways in both RET-dependent and -independent manners.In this study, artemin can stimulate neurites outgrowth and actin polymerization of the mature dorsal root ganglia (DGR) neuronal cells. Also, the increase of vesicle clustering by artemin was detected. RET and Src proteins were stimulated by the treatment with artemin. Our results showed that the inhibition of SFKs or ERK suppressed the artemin-dependent neurite growth, suggesting that these proteins could be relevant to neurite elongation in mature DRG.Although a variety of signaling proteins have been identified to be involved in the regulation of actin networks, this work surveys on a terminal signaling component, SH3-containing Nck1 in linking to the organization of actin cytoskeleton. Here, Nck1, Src, and Hck SH3-interacting proteins were screened by a GST-pull down and 2D proteomics method. Some proteins containing cytoskeletal proteins and unnamed proteins were found to interact with SH3 domains.In summary, artemin stimulates neurite growth in mature DRG neurons through interacting with RET tyrosine kinase, which stimulates intracellular signaling. ERK1/2 and SFK are related with artemin-dependent neurite growth. In the process, cytoskeletal protein and some proteins are bound to SH3 domain.