세포내 알칼리화에 따른 비정상 구조 CFTR의 세포막 발현 증가

Abstract

[한글]

낭포성 섬유증 (cystic fibrosis)은 백인에서 가장 흔한 생명을 제한하는 상염색체 열성 유전병으로 세계적으로 약 6 만여 명이 이 질병을 앓고 있다. 낭포성 섬유증을 가진 사람들은 주로 세균 감염에 의한 폐질환으로 대부분 30～40세에 생을 마감하며, 지금까지 수많은 학자들이 이 질환을 치료하기 위해 유전자 치료 등의 다양한 시도를 했지만 아직까지 치료가 어려운 실정이다. 이 질환의 원인은 cystic fibrosis trans- membrane conductance regulator (CFTR)의 유전변이에 의한 기능 상실이며, 이러한 CFTR의 유전자 변이는 낭포성 섬유증과 기관지확장증 및 만성 췌장염 등의 호흡기 및 소화기 질병을 유발하며, 최근 한국인에서도 CFTR의 유전자 변이가 기관지확장증 및 만성 췌장염 질환과 관련 있음이 밝혀졌다. 백인에서 가장 흔한 유전자 변이는 CFTR의 508 번째 phenylalanine이 결실된 형태의 CFTR (ΔF508-CFTR)을 가지는 것이다. 새로 합성된 ΔF508-CFTR은 비정상 구조를 이루기 때문에 100 %가 Endoplasmic reticulum (ER) quality control system에 의해서 분해되어 세포막으로 이동하지 못해서 질병을 유발시킨다.새로 합성된 모든 ΔF508-CFTR 및 일부 WT-CFTR은 ER에서 ER 내강 및 세포질에 존재하는 다양한 molecular chaperone과 결합하게 된다. 모든 ΔF508-CFTR과 일부 WT-CFTR은 molecular chaperone과 여러 단백질과의 상호작용에 의해서 ubiquitination된 후 ER translocon pore를 통해 밖으로 나와 26S 프로테아좀에 의해 분해되는 과정을 거치게 된다. 이때 일부 CFTR 단백질은 pre-Golgi intermediate나 cis-Golgi element까지는 이동을 하며, chaperone과 KDEL 수용체 등에 의해서 다시 ER로 역수송된 후 분해된다. cis-Golgi까지 이동한 ΔF508-CFTR의 ER로의 역수송에 가장 주된 역할을 하는 것은 골지체의 pH이다. 본 실험에서는 세포내 알칼리화가 이루어지면 골지체의 pH가 상승하게 되어 이로 인해 COPI vesicle에 의한 골지체에서 ER로의 역수송이 억제될 것이고 KDEL 수용체에 의한 ER로의 역수송 역시 억제되는 효과가 있을 것으로 가정하고, 세포내 알칼리화에 따른 ΔF508-CFTR의 세포막 발현에 대한 연구를 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 세포질 및 골지체의 알칼리화는 CHO 세포 및 CFPAC-1 세포에서 ΔF508- CFTR의 세포막 발현을 증가시키고 CFTR의 Cl- channel 기능을 회복시켰다. 그리고 세포질 및 골지체의 알칼리화는 CFTR 단백질의 발현에 영향을 주는 molecular chaperon의 발현량, 단백질의 ubiquitination 정도 그리고 프로테아좀의 활성에는 영향을 미치지 않았으며, CFTR 유전자의 발현을 약간 감소시키는 경향이 있었을 뿐 증가시키지 않았다. 또한 이러한 현상이 in vivo에서도 일어나는지 확인하기 위하여 homozygous ΔF508 생쥐에 2% sucrose와 280mM NaHCO3를 포함하는 물을 먹여 가벼운 대사성 알칼리 혈증을 유도한 경우 생후 4 개월간의 생존율이 크게 증가하였다. 그리고 NaHCO3를 섭취시킨 Homozygous ΔF508 생쥐의 소장 내강막에서 CFTR 의존적인 Isc가 크게 증가하였다.이상의 결과를 종합하여 볼 때 세포질 및 골지체의 알칼리화는 결과적으로 ΔF508-CFTR이 ER quality control system을 벗어날 수 있게 해주어 ΔF508-CFTR의 세포막 발현을 돕는 역할을 함을 알 수 있었으며, in vivo model에서도 이러한 현상이 일어남을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 결과를 바탕으로 Vacuolar H+-ATPase 특이적인 억제제를 사용한 골지체의 알칼리화를 통해서 ΔF508-CFTR이 ER quality control system을 벗어날 수 있게 해주는 것은 ΔF508- CFTR로 인한 낭포성 섬유증 치료에 새로운 방법이 될 수 있을 것이다.

[영문]The most common form of the disease-causing cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) mutation, ΔF508, leads to a misfolded protein which undergoes endoplasmic reticulum (ER)-associated degradation (ERAD). Retrieval of misfolded protein from cis-Golgi or pre-Golgi intermediate compartments is a critical factor in ER retention and ERAD of ΔF508 CFTR protein. Therefore, the inhibition of retrograde Golgi-to-ER traffic by the alkalinization of Golgi lumen may permit functional ΔF508 protein to reach the cell surface. We examined the effects of alkaline treatments on the misfolded CFTR-induced defects in cells and in mice with ΔF508 CFTR. In CFPAC-1 cells which endogenously express ΔF508 CFTR and CHO cells in which ΔF508 CFTR is heterologously expressed, intracellular alkalinization by reducing CO2 concentrations in the CO2-incubation chamber or the intra-Golgi alkalization by bafilomycin A1 treatments increased the membrane expression of ΔF508 CFTR and CFTR-dependent anion transport. Of note, chronic administration of the weak base NaHCO3 increased the long term survival of homozygous ΔF508 CFTR mice and induced CFTR-dependent short circuit currents in the intestinal epithelium. The above results imply that the escape of ERAD by alkalinization of Golgi or pre-Golgi intermediate compartments can be a potential therapeutic target for misfolded CFTR-associated diseases.