Proteomic analysis of progressive factors in uterine cervical cancer

Abstract

[한글]

Human papilloma virus(HPV)는 대략 8 kb의 유전자를 가지고 있는 작은 DNA 바이러스이다. 현재까지 연구된 바로는 HPV 감염이 자궁암으로의 진행에 있어서 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 전체 HPV 아형 중 high-risk type인 16, 18, 31, 33, 45가 90% 이상의 자궁암과 관련된 것으로 보고되어있다. 또한 최근 발표된 몇몇 논문들에서 이들 high-risk type HPV 중 16과 18이 좀 더 예 후가 좋지않은 자궁암에서 우세하게 검출되는 것을 보고함으로써 high-risk type HPV의 감염과 자궁암과의 상관관계를 좀 더 명확히 하게 되었다.현재 high-risk type HPV의 E6/E7이 P53이나 Rb과 같은 oncogene에 미치는 영향과 함께 HPV 감염에 의한 cell cycle control, chromosomal alteration, telomerase activation, 그리고 proliferation 등에 관계된 연구가 꾸준히 진행 중에 있기는 하지만 생체 내에서 실질적인 기능을 담당하는 단백질이 HPV에 감염되었을 때 어떠한 양상으로 변화하는지에 대한 연구는 부족한 현실에 있고 이것은 자궁암을 이해하고 치료하는데 있어서 상당한 어려움으로 작용하고 있다. 그러므로 이 연구에서는 high-risk type HPV 16, 18의 감염에 의해 야기되는 총체적인 단백질 발현양상의 변화를 밝혀내기 위해서 각각 high-risk type HPV 16, 18에 감염된 것으로 확인된 6명의 환자의 조직(각 아형당 3개의 조직)을 사용하였고 또한 단백질 추출과정에서 핵과 세포질을 나누어 단백질을 분리해내 그것들을 각각을 2-DE와 MALDI-TOF MS라는 proteomics의 대표적인 방법을 사용해 분석함으로서 특정 단백질의 세포 내 위치와 그 작용에 대한 상호관련성에 대한 보다 정확한 결과를 도출해 내고자 하였다.우선 HPVDNAchip(Biomedlab Co., Seoul, Korea)에 의해서 HPV 감염이 확인된 환자의 조직으로부터 핵과 세포질을 나누어 단백질을 추출해낸 다음 2-DE를 사용해 등전점(Isoelectropoint, pI)과 분자량(Molecular weight, Mr)에 의해서 각각의 단백질을 분리해 내었고 이것을 바탕으로 하여 cervical cancer와 대조군 사이의 단백질들의 differential expression을 확인한 다음 MALDI-TOF MS와 database analysis에 의해서 단백질의 정체를 확인하였다. 이렇게 정체가 확인되어진 단백질들을 SEB(Surrogate Endopoint Biomarker)에 따라서 재분리 함으로써 단백질의 기능과 세포 내 위치 그리고 자궁암 조기 진단과 치료를 위한 biomarker 발굴을 위한 기반을 마련하고자 하였고 또한 HPV 감염과 관련된 다른 암 종과의 상호연관성도 함께 도출해 내려고 하였다.이 논문에서 주목할 만한 성과는 위에서 이미 언급한 바와 같이 HPV가 자궁암을 유발하는 핵심인자 이고 이것에 의한 감염이 malignant conversion을 야기하는 것으로 확실시 되었음에도 불구하고 실제 환자의 조직에서 자궁암의 발암과정에 관련된 분자들을 단백질 수준에서 총제적으로 확인하고 체계적으로 분류한 연구가 없던 상황에서 이것에 대한 소기의 목적을 달성했다는데 의의가 있다고 할 수 있다. 또한 이미 발표된 논문들의 결과를 일부분 재확인함으로써 HPV에 의한 발암기전을 이해하고 확고히 하는데 기여했다고 본다.그리고 이 논문에서 단백질의 분류를 위해서 이용한 Surrogate Endopoint Biomarker(SEB)는 proliferation marker, regulation marker, differentiation marker, general genomic instability marker, tissue maintenance marker 등으로 세분화 될 수 있으며 MALDI-TOF MS와 database analysis에 의해서 정체가 확인된 분자들은 각각의 기능과 세포 내 위치에 근거해 세부적으로 분류하였다. 이것들 중 PCNA(Proliferating cell nuclear antigen), 14-3-3 sigma, Mdm 2와 4, Cdc25A와 B, 그리고 MCM(Minichromosome maintenance) 3,4,8 등과 같은 발암기전과 밀접한 관계를 맺고있는 중요한 단백질들이 각각의 구획에서 증가 또는 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 이중 MCM8이 아직까지도 그것의 정확한 기능과 구조가 밝혀지지 않은 것으로 고려해 볼 때 자궁암을 포함한 HPV 관련 암을 연구하는데 있어서 새로운 target이 될 수 있을 것으로 기대된다.결론적으로 이전의 연구내용 들과 이 논문의 결과를 종합해 볼 때 HPV가 자궁암의 발암과정에 있어서 명백한 원인자임을 다시 한번 확인 할 수 있었으며, 더 나아가 이전까지 부족했던 HPV 감염에 의해서 나타나는 총체적인 단백질의 발현양상을 확인 함으로써 자궁암을 진단하고 치료할 수 있는 새로운 관점을 제시했다고 본다.

[영문]Human papillomavirus (HPV) infections play a crucial role in the progress of cervical cancer. The high-risk HPV types are frequently associated with the development of malignant lesions. Some of the latest studies have demonstrated that the high-risk HPV 16 and 18 are predominantly detected in the more aggressive cancers. In the present study, we aimed to establish the proteomic profiles and characterization of the tumor related proteins by using 2-DE and MALDI-TOF MS. For proteomic analysis, patients infected by HPV 16 or 18 were included in this study. We compared nuclear protein and cytoplasmic protein, separately by using the subcellular fraction. Differential protein spots between cervical cancer with high-risk HPV, HPV 16 or HPV 18 and HaCaT Cell lines were characterized by 2-DE. Those proteins analyzed by peptide mass fingerprinting based on MALDI-TOF MS and database searching were the products of oncogenes or proto-oncogenes, and the others were involved in the regulation of cell cycle, for general genomic stability, telomerase activation and cell immortalization. However, there was no difference of protein characterization for cervical cancer between HPV 16 and HPV 18 infection. Nonetheless, these data are valuable for the mass identification of differentially expressed proteins involved in human uterine cervical cancer. Moreover, the data has enormous value for, establishing the human uterine cervical cancer proteome database that can be used in screening a molecular marker for the further study of human uterine cervical cancer, and also for studying any correlation among the cancers induced by HPV.