Toxic effect of JPK protein in bacterial system

Abstract

[한글]

Jpk는 생쥐 Hoxa-7의 위치특이적인 조절인자와 작용하는 trans-acting factor 로서 본 실험실에서 발견되었다. 최근에는 type 2 당뇨의 polygenic 동물모델인 Psamommys obesus에서 당뇨와의 관련성이 발표되었고, selenocysteine을 포함하는 selenoprotein으로 알려져 있으나 정확한 세포내 기능은 현재까지 알려져 있지 않다.본 연구에서는 Jpk를 박테리아 세포에서 발현 시켰을 때 어떠한 기능을 하는지 알아보기 위해, pGEX-4T-1 벡터로 클로닝하여 GST-Jpk 융합단백질을 제조하였다. SDS-PAGE 분석결과 GST-Jpk 융합단백질의 크기는 약 48 kDa 이었다. 또한 컴퓨터 프로그램을 이용한 염기서열과 단백질 구조 분석에서 1개의 transmembrane domain, 3개의 glycosylation site, 수개의 phosphorylation site를 갖는 것으로 분석되었다. 그런데, 세포생장곡선 측정실험결과 Jpk가 박테리아세포에서 발현되면 30분 이내로 숙주세포의 생장을 억제했다. 전자현미경 관찰결과 Jpk를 발현하는 세포에서 비정상적으로 신장되어 결국에는 세포를 터트려 숙주세포를 죽이는 결과를 확인하였다. Jpk가 박테리아 세포를 죽이는 현상을 연구하기 위하여, Jpk의 N-terminal 부분, 그리고 C-terminal 부분만을 포함하는 pGEX 벡터를 만들었다. 흥미롭게도, 생장곡선측정과 전자현미경관찰 결과 등에서 N-terminal 부분을 포함하고 있는 GST 융합단백질이 C-terminal을 포함하고 있는 것보다 숙주세포에 더 강한 독성효과를 보였다.박테리아 세포에서 독성을 나타내는 Jpk의 기전에서 활성산소족 (ROS)과의 연관성을 알아보기 위하여 Jpk를 포함하고 있는 세포에 항산화제인 DTT를 처리하였다. 세포생장측정, 생존세포수(C.F.U.) 측정 그리고 박테리아 spot test를 실시한 결과, DTT가 농도에 따라 Jpk를 발현하는 세포의 생존율을 증가시켰다. 이 결과는 Jpk의 세포독성효과가 ROS와 관련되어 있을 가능성을 시사하는 것이다. 또한 박테리아 유전자 library를 작성한 다음, Jpk의 세포독성효과를 억제하는 유전자를 포함하는 클론(pBluescript:SD)을 분리하였다. 염기서열 분석결과 이 클론은 박테리아의 yafN-yafO의 일부를 포함하고 있는 것으로 분석되었다.본 연구에서는, 생쥐 Hoxa-7의 위치특이적인 조절인자와 작용하는 trans-acting factor로 발견된 고등생물의 유전자인 Jpk를 원핵생물인 박테리아 세포에서 발현시켜서 숙주세포를 죽이는 기능을 확인하였고, 항산화제인 DTT처리에 의해 이러한 현상이 감소되는 것으로 보아 Jpk의 세포독성효과가 활성산소족에 의해서 발생되며, 박테리아의 toxin-antitoxin system과 관련된 yafN과, yafO의 SOS 반응에 의하여 Jpk의 독성을 감소시키는 대처 기전이 박테리아에 있는 것으로 보인다.

[영문]In order to understand the function of the Jpk, a trans-acting factor interacting with the position-specific regulatory element of a murine Hoxa-7, the cDNA of the Jpk was cloned into the pGEX-4T-1 vector to produce a GST fusion protein. Sequence analysis revealed that Jpk encode 187 a.a. containing an ER membrane retention signal, one transmembrane domain, 3 plausible glycosylation sites and several potential phosphorylation sites. The size of the fusion protein was determined to be 48 kDa by SDS-PAGE. However, Jpk protein inhibited the bacterial growth within 30 minutes after induction with IPTG. The transmission electron microscopic (TEM) examination revealed that the morphology of the cells expressing Jpk was changed dramatically: i.e., unusually elongated phenotype compared with those of controls, and finally leading to cell death. To find the domain responsible for its cytotoxicity, deletion clones were made. Interestingly, the N-terminus of Jpk, Jpk(N) harboring a putative transmembrane domain displayed more toxicity to bacterial cell than the C-terminus. The morphology of E. coli cells expressing Jpk(N) was similar to those expressing intact Jpk protein when analyzed under trans electron microscope.To explain the relationship between Jpk induced toxic mechanism and reactive oxygen species (ROS) in bacterial cell, antioxidants were treated to Jpk harboring bacterial cells. In spotting and C.F.U. tests, DTT exhibited a concentration dependent protective effect against the bacterial toxicity of Jpk. Furthermore, as part of a study to identify molecules that suppressing the cytotoxic function of Jpk, we attempted to construct a bacteria chromosomal DNA library. Through cotransformation analysis, one clone pBluescript:SD was selected by being reducing Jpk caused death of host bacteria. Sequence analysis revealed that pBluescript:SD contained an E. coli DNA fragment compassing yafN-yafO. Through computer analysis, the function of yafN and yafO was analyzed to be associated with the toxin-antitoxin systems related to the SOS response probably caused by the Jpk toxicity. Consequently, the results of this study suggested that Jpk toxic mechanism is related to ROS generation and the reduction of Jpk toxicity is associated with the response of bacterial toxin-antitoxin system in bacterial system.The function of Jpk in bacterial system and comprehensive characterization of Jpk would help us to enlarge out understanding about cell death mechanism and probably the regulatory cascade of Hox gene.