E1A 및 E1B 돌연 변이 양상에 따른 종양 선택적 복제가능 아데노바이러스들의 세포 살상 효과 비교

Abstract

[한글]

암 유전자 치료에 이용되던 초기 아데노바이러스 벡터는 치료 유전자가 삽입된 형태의 증식 불가능 아데노바이러스로 일회성의 감염으로 인한 제한적인 치료 효과가 문제점으로 대두되었다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 정상 세포에서는 바이러스의 복제가 제한되면서 종양 세포만을 선택적으로 살상할 수 있는 종양 특이적 살상 아데노바이러스의 개발 및 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 아데노바이러스 복제에 필수적인 E1A 단백질을 기본적으로 발현하면서 E1B19 kDa 또는 E1B 55kDa 유전자가 선택적으로 제거될 때의 종양 살상 효과를 비교 검증하였다. 제작된 E1B 변이형 아데노바이러스들(Ad-ΔE1B19/55, Ad-ΔE1B19, Ad-ΔE1B55)의 세포 살상 효과는 E1B19 kDa 단백질의 발현이 결여될 때 증가하였으며, 감염된 세포 내에서의 세포고사 유도 및 주변 종양 세포로의 확산 효과 또한 크게 증대되었다. 그리고 E1B55 kDa 유전자도 함께 결손된 Ad-ΔE1B19/55는 증진된 종양 살상 효과 뿐 아니라 p53 단백질 의존적 복제 기전에 따라 종양세포 선택적 살상능을 유도하였다. 또한, 종양 특이적 살상 아데노바이러스의 암세포 특이적 복제능을 증진시키기 위하여 E1A 유전자 부위 중 retinoblastoma 단백질(pRb)과의 결합에 관여하는 CR1과 CR2 부위를 다른 아미노산으로 치환, 혹은 결손시켜 11 종류의 Ad-E1A 변이형 아데노바이러스(Ad-E1Amt#1 ～ #11)들을 제작하였다. 종양 세포에서는 p53 단백질의 변이 뿐 아니라 pRb의 돌연변이 혹은 pRb 관련 신호 기전이 상당부분 손상되어 있기 때문에, pRb와의 결합능이 상실된 아데노바이러스는 정상 세포에서는 바이러스 복제에 관련된 세포 내 환경이 제대로 형성되지 않아 복제가 억제되지만 세포 주기가 왕성하게 작동되는 종양 세포에서는 활발하게 복제되어 암세포를 선택적으로 살상할 수 있다. 본 연구에서 제작한 11 종류의 E1A 변이체 아데노바이러스들 중 종양 세포 살상능과 더불어 정상 세포에서의 선택적인 복제 억제능이 가장 우수한 Ad-E1Amt#7 변이형 아데노바이러스를 최종 선정하여, p53 의존적 복제 선택성과 세포 살상능을 증진시키기 위하여 E1B19 kDa와 E1B55 kDa 유전자를 결손시킨 Ad-ΔB7 아데노바이러스를 최종적으로 제작하였다. Ad-ΔB7 아데노바이러스는 종양 선택적 복제 및 살상 효과와 더불어 생체내 실험에서도 높은 항종양 효과를 나타내었다. 결론적으로 Ad-ΔB7 아데노바이러스는 암세포에 대한 높은 선택적 세포 살상능을 보여, 암 유전자치료에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

[영문]Gene-attenuated replication-competent adenoviruses are emerging as a promising new modality for the treatment of cancer. For the aim of improving adenoviral vectors for cancer gene therapy, we have constructed genetically attenuated replicating adenoviruses (Ads) with different combinations of E1A & E1B mutant genes and investigated the possibility of enhanced oncolytic and replication effects of these engineered replication-competent Ads. We show here that cytolytic potency of each gene attenuated replicating adenoviruses differed significantly depending on the presence or deletion of E1B 55kD and E1B 19kD function. More specifically, among the constructed (Ad-DE1B19, Ad-E1B55, Ad-E1B19/55, and Ad-wt), E1B 19kD-inactivated adenovirus (Ad-DE1B19) was the most potent against all tumor cells tested, inducing the largest-sized plaques and marked CPE. Further, cells infected with either Ad-DE1B19 or E1B19/55kD-deleted adenovirus (Ad-E1B19/55) showed complete cell lysis with disintegrated cellular structure whereas cells infected with Ad-wt maintained intact cellular and nuclear membrane with properly structured organelles. Apoptosis assays (TUNEL, DNA fragmentation assay, flow cytometry analysis and mitochondrial membrane potential change assay) also revealed that E1B19 kDa gene deleted Ads (Ad-ΔE1B19/55 and Ad-ΔE1B19)-infected cells showed more profound induction of apoptosis in comparison to Ad-ΔE1B55- or Ad-wt-infected cells. The presence of E1B55 kDa gene was required for efficient viral replication, and the deletion of E1B19 kDa function induced apoptosis, leading to increased CPE and viral release. Ad-ΔE1B19/55 showed p53-dependent CPE leading to enlarged tumor-killing effect and viral spreading. As an additional effort to increase cancer cell-selectivity of replicating adenovirus, we have generated eleven E1A-mutant Ads (Ad-mt#1 ～#11) with deletion or substitution in retinoblastoma (Rb) binding sites of E1A. Of these viruses, Ad-mt#7 demonstrated significantly improved CPE and viral replication in a cancer cell-specific manner. To further increase the cancer cell-specific cell killing effect of Ad-mt#7 adenovirus, both E1B19 kDa and E1B55 kDa gene was deleted, resulting in an Ad-ΔB7 Ad. As assessed using CPE assay, MTT assay, and Ad fiber immunoblot analysis, Ad-ΔB7 exerted markedly enhanced cancer cell-specific killing effect as well as viral replication in comparison to either Ad-mt#7 or Ad-ΔE1B19/55 Ad. Furthermore, the growth of established human cervical carcinoma in nude mice was significantly suppressed by intratumoral injection of Ad-B7. In summary, we have developed replication competent adenoviruses with significantly improved therapeutic profiles for cancer treatment.