사람 망막아종에 발현된 퓨린성 수용체의 특성

Abstract

[한글]

ATP(adenosine 5''-triphosphate)는 세포내에서 일차적인 에너지원으로 이용될 뿐만 아니라 세포외에도 미량 존재하며 세포내 다양한 생리적 기능에 관여하는 것으로 알려져 있다. 세포외액의 ATP와 같은 adenine 뉴클레오티드 및 adenosine의 작용은 세포외막에 존재하는 수용체를 매개로 이루어지는데, 이러한 수용체를 퓨린성 수용체(purinergic receptor)라 하며, 크게 P1과 P2 수용체로 구분한다. 퓨린성 수용체는 정상적으로 세포의 발달, 증식, 분화, 세포사멸 등의 세포주기 신호전달 과정에 밀접한 관련을 갖고 있으며, 종이나 세포에 따라 수용체의 발현 및 생리적 특성이 다양한 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 소아의 망막에서 치명적인 암을 유발시키는 사람 망막아종 세포를 대상으로 퓨린성 수용체의 특성과 그 생리적 기전의 일부를 규명하고자 하였다. 퓨린성 수용체의 활성화 여부를 확인하기 위해서 망막아종 세포주의 하나인 WERI-Rb-1 세포를 대상으로 칼슘 이미징(imaging) 기법을 이용하여 세포내 칼슘농도 ([Ca2+]i)를 측정하였으며, 망막아종 세포막에 발현된 퓨린성 수용체의 아형을 관찰하기 위해 역전사 연쇄 중합반응 (RT-PCR)과 Western blot 방법을 이용하였다. 본 연구를 통해 규명된 주요 결과는 다음과 같다.

칼슘 이미징 실험에서 10 μM의 ATP를 투여하였을 때 대부분의 망막아종 세포에서 (80% 이상) 현저한, 일과성 [Ca2+]i 증가를 보였으며 (n=46), 이와 같은 변화는 농도의존적으로 나타났다. 퓨린성 수용체의 활성화에 따른 [Ca2+]i 증가는 세포외 칼슘이 제거된 조건에서도 90.7±1.0% 이상 유지되었다 (n=48). 역전사 연쇄 중합반응 (RT-PCR)을 관찰한 결과 망막아종 세포에서 P2Y1,2,4,6,8,11,12 아형의 퓨린성 수용체를 코딩하는 mRNA들이 확인되었다. 퓨린성 수용체 각 아형의 활성화를 확인하기 위해 효현제 및 차단제를 사용한 결과, P2Y1 수용체 효현제 (2MeS-ATP, 1 μM)에 의한 세포내 칼슘농도 증가는 ATP (10 μM)에 의한 [Ca2+]i의 85.9±3.1%에 이르나 P2Y1의 선택적 차단제인 MRS 2179 (30 μM) 투여시 대부분 (86.3±2.3%)이 억제되었다 (n=76). 그러나 P2Y2,4,6 효현제인 UTP (100 μM)에 의한 [Ca2+]i 에는 거의 변화가 없었다. P2Y11 수용체 아형의 효현제인 BzATP (100 μM)에 의한 [Ca2+]i 은 대조군의 31.2±3.7%에 해당하였다. 한편, phospholipase C (PLC) 차단제 (U-73122, 1 μM) 및 Ca2+-ATPase 차단제 (thapsigargin, 1 μM)에 의해서는 각각 대조군의 10.4±1.8% (n=55), 8.1±0.9% (n=52)로 대부분 억제되었다. 반면에, PLC 차단제인 U-73122의 유사체 (isoform)인 U-73343 (1 μM) 투여시에는 세포내 칼슘농도의 억제가 유의하게 관찰되지 않았다 (n=69). RT-PCR에서 IP3-1, IP3-2 수용체 아형의 mRNA가 확인되었으며, IP3 수용체 차단제인 2-APB (20 μM)는 ATP에 의한 세포내 칼슘농도의 증가를 92.5±1.3% 억제하였다 (n=71). 마지막으로 퓨린성 수용체 단백질을 확인하기 위한 Western blot 방법을 통해 P2Y1 수용체 단백질의 발현을 확인하였다.

이상의 결과를 종합해 볼 때, 망막아종 세포에는 P2Y1 수용체가 주로 발현되어 있으며, 이 수용체의 세포내 신호전달 기전은 PLC 경로를 통한 세포내 저장소로부터 칼슘동원에 관여하는 것으로 나타났다. 퓨린성 수용체를 통한 세포내 칼슘동원 기전은 사람 망막아종 세포의 분화와 성숙에 필수적인 과정으로 사료된다. 본 연구의 결과는 사람에서 망막아종의 발생과정에 퓨린성 수용체가 관여하는 기전에 대한 이해의 폭을 넓히는 중요한 기초정보로 활용할 수 있을 것으로 본다.

[영문]ATP (adenosine 5''-triphosphate) is the essential energy source in the cell. It is also well known that ATP plays significant roles in the various physiological functions being present outside the cell. This role of ATP is actually mediated by the purinergic receptor. Expression profiles and physiological characteristics of the purinergic receptor vary according to the species and the cell types. Therefore, this study was performed to clarify the characteristics of purinergic receptor and a part of its physiological mechanisms especially in the human retinoblastoma. To achieve this goal, we performed two series of experiments in the WERI-Rb-1 cell, one of retinoblastoma cell lines. Firstly, intracellular [Ca2+]i transient was measured by using Ca2+ imaging technique to clarify the active involvement of purinergic receptor. Secondly, subtypes of purinergic receptor were pursued by using RT-PCR and western blot. Results were as follows;

1. 10 µM ATP elicited strong but transient increase in [Ca2+]i higher than 80% in the WERI-Rb-1 cells (n=46) in a concentration-dependent manner. This [Ca2+]i increase was well maintained by higher than 90.7+1.0 % after external Ca2+-depletion (n=48). In the WERI-Rb-1 cells, mRNAs for purinergic P2Y1,2,4,6,8,11,12 subtypes were identified by using RT-PCR and P2Y1 receptor protein was also identified by using western blot.

2. P2Y1 agonist (2MeS-ATP, 1 µM) also increased [Ca2+]i up to 85.3+3.1 % of 10 µM ATP-induced response and P2Y1 selective blocker (MRS 2179, 30 µM) suppressed almost of this response (86.3+2.3%). However, P2Y2,4,6 agonist (UTP, 100 µM) elicited no response in [Ca2+]i and P2Y11 agonist (BzATP, 100 µM) increased [Ca2+]i only by 31.2+3.7% of ATP effect.

3. Phospholipase C inhibitor (U-73122, 1 µM) modestly suppressed the 10 µM ATP-induced response eliciting 10.4+1.8% increase in [Ca2+]i (n=55), while its isoform (U-73343, 1 µM) had no suppression (n=69). Ca2+- ATPase inhibitor (thapsigargin, 1 µM) also elicited a modest suppression on the ATP-induced response eliciting 8.1+0.9% increase in [Ca2+]i (n=52).

4. IP3 receptor blocker (2-APB, 20 µM) suppressed the 10 µM ATP-induced response by 92.5+1.3% (n=71) and, interestingly, IP3 receptor subtypes of IP3-1 and IP3-2 were actually identified by RT-PCR.

All these results together indicate that P2Y1 purinergic receptor is mainly expressed in retinoblastoma cell, which activates Ca2+ release from internal Ca2+ storage sites via the PLC-mediated pathway. Therefore, it is concluded that this purinergic receptor-mediated Ca2+ mobilization works as an essential mechanism involved in the differentiation and maturation of retinoblastoma cells.