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사람 telomerase promoter에 의해 DR4 발현이 조절되는 재조합 adenovirus와 TRAIL 병합 처리에 의한 암세포의 선택적 세포 사멸 유도

Other Titles
 Selective induction of apoptosis in cancers by hTERT promoter controlled 
Authors
 최은아 
Issue Date
2004
Description
의과학과/석사
Abstract
[한글] 현재까지 TRAIL을 이용한 유전자 치료는 CMV promoter를 이용한 adenovirus로부터 TRAIL을 과발현하거나 telomerase promoter에 의 해 TRAIL 발현이 조절 받는 adenovirus를 제조하여 그 연구가 진행 되었으나, 이 경우에는 TRAIL에 민감한 세포에서만 그 효과를 관찰할 수 있었다. 본 연구에서는 암세포에서만 세포 사멸을 유발하는 물질로 알려진 TRAIL에 대한 세포막 수용체 DR4를 사람 telomerase promoter를 이용하여 암세포에서만 선택적으로 발현할 수 있도록 하는 재조합 adenovirus를 제조하고, 재조합 adenovirus 단독 또는 재조합 TRAIL 단백질 또는 TRAIL을 과발현할 수 있는 adenovirus와 함께 처리하여 TRAIL에 대한 내성이 알려진 암세포에 대한 세포 사멸 효과를 검증하여 향후 인간을 대상으로 하는 유전자 치료 기술의 근간을 마련하고자 하였다. 이를 위하여 human genomic DNA로부터 human telomerase promoter 부위를 cloning하고 표적 세포로 사용할 암세포에서의 telomerase 활성도를 luciferase assay를 통해 측정한 결과 자궁 경부암세포인 Caski와 식도 상피 세포암인 HCE4에서 정상 자궁 경부 상피 세포보다 높은 활성을 관찰할 수 있었다. Ubiquitin E3 ligase 활성을 가진 E6AP 단백질과 함께 p53 종양 억제 단백질을 파괴한다고 알려져 있는 HPV 16, 18형으로부터 발현되며 telomerase promoter의 활성을 증가시키는 것으로 알려진 종양 단백질중의 하나인 E6 단백질을 과발현시킨 경우 그렇지 않은 경우보다 telomerase promoter 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 암세포 특이적 활성이 확인된 telomerase promoter와 full length DR4 유전자가 함께 포함된 shuttle plasmid construct를 제조한 뒤, pAd-Easy I system을 이용하여 재조합 adenovirus Ad-hTERT-DR4를 293세포에서 생성 및 증폭하였으며, TRAIL에 내성을 가지는 암세포 CasKi와 HCE4에 감염시켜 DR4를 과발현시키고 TRAIL과 병합 처리 시에 세포 사멸 효과를 western blot immunostaining과 flow cytometry를 통해 세포 배양 모델에서 확인하였다. 그 결과 단독 처리시 보다는 병합 처리시 세포 사멸의 정도를 보여주는 단백질인 PARP나 pro-caspase 3의 절단이 확인되었고, flow cytometry에서 sub-G1 fraction이 증가하는 것으로 보아 Ad-hTERT-DR4와 Ad-ILZ-TRAIL 또는 재조합 TRAIL 단백질의 병합 처리 시 암세포의 성장 억제 및 세포 사멸 효과를 확인할 수 있었다. TRAIL에 대한 내성을 가진 세포인 HCE4와 HCE7에 Ad-hTERT-DR4와 Ad-ILZ-TRAIL을 각각 infection 시키고 난 후 다시 두 세포를 같이 배양하였을 때 HCE4의 세포 사멸을 확인함으로써 TRAIL과 DR4를 병행 사용 하였을 경우 TRAIL에 내성을 가진 암세포 치료에 유용한 치료법이 될 수 있음을 증명하였다. 이러한 TRAIL과 DR4를 이용한 TRAIL 내성을 가진 암세포 사멸 효과가 암세포 선택적 현상이라는 것을 확인하기 위해 정상 자궁 경부 상피 세포에 Ad-GFP, Ad-hTERT-DR4, Ad-ILZ-TRAIL, Ad-E6를 infection 한 후 PARP와 pro-caspase 3의 절단 여부를 확인한 결과 절단 정도가 거의 나타나지 않았으며 sub-G1 fraction도 거의 증가하지 않은 것으로 보아 TRAIL과 hTERT-DR4를 이용한 암세포 사멸은 암세포 선택적인 것으로 확인하였다. 이상의 결과로 암세포에서만 선택적으로 TRAIL의 수용체인 DR4의 발현을 유도하고 TRAIL을 병합 처리하여 TRAIL에 대한 내성을 가진 암세포의 세포 사멸을 유도하는 것은 암세포 선택적인 것이며 향후 암의 치료에 있어 이용 가능할 것으로 생각된다.
[영문]Telomerase activity is detected in more than 90% of immortalized and cancer cells but absent in most normal somatic cells and HPV E6 oncoprotein could activate telomerase. In this experiment, we hypothesized that the hTERT promoter can be used for tumor-specific expression of transgenes to induce selective cancer cell death in TRAIL-resisitant or HPV E6 positive cancer cells. First, we tested whether hTERT core promoter is active only in cancer cells and whether the presence of HPV E6 protein could potentiate the activation of the promoter by using luciferase constructs and we found that hTERT promoter is active only in cancer cells, and the presence of E6 protein could agument hTERT promoter activity. Then, we generated adenoviruses to express TRAIL-death receptor (DR) 4 driven by hTERT promoter to test whether the expression of DR4 is induced by the promoter in cancer cell lines in the presence or absence of E6 oncoprotein and we found that DR4 expression was induced. Finally, we tested whether TRAIL treatment and the induction of DR4 could contribute to selective cancer cell death by observing caspase 3 activation and PARP cleavage, and we found that death of Ad-hTERT-DR4 infected cells were increased in the presence of TRAIL. Taken together, our results reveal that the proper use of hTERT promoter could be useful and powerful for inducing selective cancer cell death with effective death inducing transgenes such as DR4.
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1. College of Medicine (의과대학) > Others (기타) > 2. Thesis
URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/122175
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