Effects of altered DNA repair genes on the tumorigenesis and progression of colorectal carcinomas with microsatellite instability

Abstract

[한글]

고빈도 현미부수체 불안정형(microsatellite instability, MSI-H) 종양은 DNA 복제오류 교정 유전자의 결합으로 발생하며, 이로 인해 종양연관 유전자의 단백질 지령부위에 존재하는 현미부수체 (coding mononucleotide repeats, cMNR) 에 체이동 돌연변이가 발생하여 결과적으로 해당유전자의 기능적 이상이 초래되어 암 발생 및 진행이 일어나는 종양이다. 본 연구에서는 MSI-H 종양에서 표적이 되는 종양연관 유전자중 DNA 수선에 관련된 유전자의 변이가 암발생에 어떤 영향을 주는가를 밝히고자 하였다.

MSI-H 종양의 표적유전자로 이전에 보고 된 표적유전자와 unigene 데이터베이스 탐색을 통해 10 개 이상의 cMNR 을 포함하는 45 개를 대상으로 체이동 돌연변이를 조사하였으며, 이들 돌연변이형 전사체 발현을 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)로 조사하였다. 검색된 45개의 표적유전자중 DNA 수선에 관여하는 유전자는 10 개 이었으며 이중 hMSH3, hRad50 유전자의 돌연변이 율이 56% (22/39), 33% (13/39) 로 가장 높았다. hRad50 유전자의 돌연변이형 전사체는 발현되지 않았으며, 단백질 합성 억제제인 puromycin 을 처리하거나 nonsense mediated decay (NMD) system 구성 유전자인 hUpf1 또는 hUpf2 를 처리하였을 때 발현되었다. 표적유전자의 돌연변이와 chromosomal imbalances (CIs) 의 관계를 조사한 결과 hRad50 유전자의 이상은 CIs 와 관계가 있음을 밝혀 hRad50 의 돌연변이에 의해 MSI-H 종양에서 염색체변형이 촉진됨을 시사하였다. MSI-H 종양 및 세포에서 hRad50의 발현은 hRad50 유전자의 돌연변이에 의해 감소되었으며 hRad50 과 복합체를 이루는 hMRE11은 MSI-H 종양 모두에서 감소되어 있었다. 이와 함께 MSI-H 종양에서는 hMRE11의 splicing variant 가 모두 관찰되었다. 따라서 MSI-H 종양에서 hRad50의 돌연변이로 인해 정상 hRad50 유전자의 발현양이 저하되고 결국은 DNA 수선에 작용하는 복합체의 양이 줄어듬을 알수 있었다.

이러한 결과는 MSI-H 종양에서 일어난 hRad50 유전자의 체이동 돌연변이가 CIs 를 일으키는 직접적인 원인이 될수 있음을 시사한다.

[영문]Tumors with microsatellite instability (MSI-H) are caused by defects in DNA mismatch repair genes and accumulated frameshift mutations in coding mononucleotide repeats (cMNR) of various tumor related genes in the tumorigenesis and progression of this type of tumors. This study elucidated the effects of altered DNA repair genes in the tumorigenesis of MSI-H colorectal carcinomas.

Frameshift mutations of 45 genes which have been reported as candidate target genes with mutation frequencies of more than 30%, and containing more than 10 mononucleotide repeats in its coding region searched by Unigene database, were included in this study. Expression of these genes was analyzed by using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Ten DNA repair genes were involved in this study. In these DNA repair genes, hMSH3 (56%, 22/39) and hRad50 (33%, 13/39) showed the highest frameshift mutation frequency. We could not identify frameshift mutant transcripts of hRad50 in RT-PCR analysis and the mutant transcripts reappeared when treated with puromycin, a kind of translation inhibitor, or treated with hUpf1 siRNA or hUpf2 siRNA which are known as key molecules in nonsense-mediated mRNA decay (NMD). To clarify the effects of altered DNA repair genes in the tumorigenesis and progression of MSI-H tumors, we analyzed genomic instabilities in MSI-H colorectal carcinomas. Analysis of relationship between chromosomal imbalances (CIs) and mutation status of DNA repair genes revealed that there is a significant relationship between hRad50 mutation and CIs in MSI-H colorectal carcinomas. Expression of hRad50 was decreased in MSI-H colorectal carcinomas and mismatch repair (MMR)-deficient colorectal cancer cell lines. Expression of hMRE11, which form a complex with hRad50, was also decreased in MSI-H colorectal cancer cell lines. hMRE11 showed frameshift mutation and alternative splicing in all of our 7 MMR-deficient cancer cell lines.

In conclusion, frameshift mutation of hRad50 may play an important role in development of CIs in MSI-H colorectal carcinoma.