Cellular differentiation-induced attenuation of LPS response in HT-29 cells is related with down-regulation of TLR4 expression

Abstract

[한글]

소화관 상피세포가 단지 물리적인 장벽일 뿐만 아니라 면역 반응의 시작과 유지에 능동적인 역할을 하는 것으로 알려짐으로써 그 조절 기전에 대해 관심이 모아지고 있다. 정상적으로 미분화된 crypt의 장상피는 villus로 이행하면서 분화를 하게 되며, 이 과정에서 세포의 모양과 기능이 변하게 된다. 이러한 분화 과정 중에서 면역반응의 변화로서 IL-1β에 대한 반응의 감소가 보고가 되었다. 장내 박테리아의 LPS는 염증성 장질환의 병인에서 중요한 역할을 할 것으로 생각이 되어 왔다. 최근에 들어서 LPS에 대한 염증반응을 매개하는 것으로 알려진 TLR4 수용체가 장상피세포에 존재하는 사실이 알려지면서 LPS에 대한 반응의 조절기전에 대해 관심이 모아지고 있다. 본 연구는 장상피세포의 분화가 LPS에 대한 IL-8 생성과 TLR4의 발현에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. HT-29 세포를 분화시키는 방법으로는 butyrate를 처리하거나 confluence이후로 배지를 교체하며 지속적으로 배양하는 자발적 분화 방법을 이용하였고 분화의 정도를 확인하기 위해 AP 활성도를 측정하였다. LPS에 대한 IL-8 반응은 ELISA로 측정하였고, TLR 4 발현 변화를 보기 위해 western blot과 RT-PCR을 이용하였다. 정상 소장 조직에서 TLR4의 발현을 보기 위해 면역조직화학염색을 시행하였다.

1. HT-29세포는 LPS로 자극하였을 때 대해 용량의존적으로 반응하여 IL-8을 생산하였고, 100 ng/ml 농도에서 plateau를 이루었다.

2. Confluence 이후로부터 배양하는 기간(0-7일)이 길수록, 그리고 처리한 butyrate (0-3 mM)의 농도가 높을수록 AP 활성도가 증가하였다.

3. HT-29세포에서 분화를 유도하면 LPS에 대한 반응이 감소하였다.

4. HT-29세포에서 분화를 유도하면 TLR4 m-RNA와 단백질의 발현이 감소하였다.

5. TNF-α (20 ng/ml, 12시간)와 INF-γ (40 ng/ml, 12시간)의 전처치는 HT-29세포에서 LPS에 대한 반응을 증폭시키고 TLR4 m-RNA 발현을 증강시켰다.

6. TNF-α와 INF-γ에 의한 LPS에 대한 반응 증폭과 TLR4 발현 증강은 분화에 의하여 감쇄되었다.

7. 정상 소장조직에서 TLR4는 crypt의 하부에만 발현되었다.

이상의 결과로 HT-29세포에서 세포의 분화에 따른 LPS 반응의 감소는 LPS 수용체인 TLR4의 발현 감쇄와 연관된다고 생각하였다.

[영문]Intestinal epithelial cells are not only a physical barrier to bacteria but also display active role in immune and inflammatory responses. The migration of epithelial cells from the crypt base to the surface is accompanied by cellular differentiation that leads to important morphological and functional changes. It has been reported that differentiation of intestinal epithelial cells is associated with reduction of interleukin (IL)-8 response to IL-1β. Although toll-like receptors4 (TLR4) has been identified as one of the important components of innate immunity to lipopolysaccaride (LPS) in intestine, little is known about regulation of TLR4 in intestinal epithelial cells during cellular differentiation. We investigated the effects of differentiation on LPS-induced IL-8 secretion and expression of TLR4. Differentiation was induced by treatment with butyrate or post-confluence culture and was assessed by measuring alkaline phosphatase (AP) activity. IL-8 secretion was measured by ELISA. TLR4 protein and mRNA expressions were examined by Western blot and RT-PCR, respectively. Immunohistochemistry was performed to demonstrate spatial expression of TLR4 along the crypt-villus axis in human small intestine.

HT-29 cells were dose-dependently responsive to LPS. AP activity was increased in HT-29 cells by differentiation induced by treatment with butyrate or post-confluence culture. IL-8 secretion induced by LPS was strongly attenuated in differentiated cells compared with that in undifferentiated cells. Cellular differentiation also attenuated TLR4 mRNA and protein expressions. Pretreatment with tumor necrosis factor (TNF)-α and interferon (INF)-γ in HT-29 cells augmented not only LPS-induced IL-8 secretion but also TLR4 expression. These TNF-α- or INF-γ-induced augmentations of LPS response as well as TLR4 expression were down-regulated by differentiation. In human small intestine, TRL4 was expressed predominantly in epithelial cells located in the lower portion of the crypts.

Collectively, we concluded that cellular differentiation attenuated IL-8 secretion induced by LPS in HT-29 cells and this attenuation was related with down-regulation of TLR4 expression.