백서 폐동맥 내피세포에서 cytokine 및 내독소에 의한 nitric oxide 생성과 미토콘드리아 aconitase 활성도의 관계

Abstract

[한글]

산화질소(nitric oxide: NO)는 혈관 내피세포 기원 이완인자(endothelium-derived relaxing factor)로서 혈관 및 신경계의 생리적 조절에 중요한 전령(messenger)이며 혈관 내

피세포에는 구성형(constitutive form)의 nitric oxide synthase(cNOS) 외에도 유도형(inducible form)의 NOS(iNOS)가 존재한다. 급성 폐손상 및 성인형 호흡곤란 증후군의 경우 내독소혈증(endotoxemia)이 주요 원인으로 INFγ, TNFα 등의 cytokines가 다량 나오고 THFα가 세포 손상의 주된 요인이다. INFγ, TNFα, 내독소를 복합하여 자극하면 iNOS를 활성화시킬 수 있으나 그 자극의 조합과 용량은 각각의 세포에 따라 차이가 있다. 급성 폐손상 및 성인형 호흡곤란증후군의 병인에 유사하게 LPS를 포함하여 iNOS에 중요한 INFγ, 내독소 쇼크에서 중요한 cytokine인 TNFα 등을 복합하여 NO 생성을 촉진시킬 수 있는지 여부와 iNOS 자극에 필요한 자극의 조합 및 그 용량을 조사하였으며, NO는 철과 쉽게 반응하므로 iron-sulfur 구조체가 촉매작용의 주된 역할을 하는 효소인 미토콘드리아 aconitase 활성도가 NO 생성시 변화하는지 여부 및 iNOS 길항제인 N-monomethyl-L-arginine(L-NMMA)의 병용 투여로 미토콘드리아 aconitase 활성도 변화가 NO 생성과 연관이 있는지 여부를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 백서 폐 미세혈관 내피세포의 무처치 대조군, IFNγ 250 U/ml 및 500 U/ml, TN7α 150 U/ml 및 300 U/ml, LPS 5 및 10㎍/ml 단일 자극군에서는 48시간까지 nitrite 생성이 측정되지 않았다.

2. 상기 자극을 복합시 12시간 부터 nitrite가 측정 가능하였으며 48시간까지도 배양액 중 nitrite가 증가하였다. 12 well plates에서 24시간 자극시 배양액 중 nitrite 농도가 24시간에 TNFα 300 U/ml, LPS 5㎍/ml 자극군에서 가장 낮고 IFNγ 500 U/ml, TNFα 300 U/ml, LPS 5㎍/ml 자극군에서 가장 높으면서 IFNγ가 없거나 250 U/ml인 군 및 LPS가 없는 군에 비하여 유의하게 nitrite가 높았다(n=3, P<0.05).

3. 24시간 자극시 nitrite 농도는 IFNγ 500 U/ml, TNFα 300 U/ml, LPS 5㎍/ml 자극군에서 20±1.0μM이었으며 IFNγ 500 U/ml, TNFα 300 U/ml, LPS 5㎍/ml, L-NMMA 0.5 mM군에서 3±0.5μM로 L-NMMA에 의하여 NO 생성이 유의하게 억제되었다(n=4; P<0.05). 미토콘드리아 aconitase 활성도는 무처치 대조군의 48±14 nmole/min에 비하여 IFNγ 500 U/ml, TNFα 300 U/ml, LPS 5㎍/ml 자극군에서 19±6 nmole/min으로 유의하게 감소되었고(n=4; P<0.05), IFNγ 500 U/ml, TNFα 300 U/ml, LPS 5㎍/ml, L-NMMA 0.5 mM 군에서 34±8 nm

ole/min이었다. Mitochondrial aconitase 활성도를 단백치로 보정시 대조군의 196±8 nmole/min/mg of protein에 비하여 IFNγ 500 U/ml, TNFα 300 U/ml, LPS 5㎍/ml 자극군에서 102±34 nmole/min/mg of protein으로 유의하게 감소하였고(n=4; P<0.05), IFNγ 500 U/

ml, TNFα 300 U/ml, LPS 5㎍/ml, L-NMMA 0.5 mM 군에서 161±24 nmole/min/mg of protein으로 자극군에 비하여 유의하게 높으나(n=4; P<0.05) 대조군에 비하여는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

이상의 결과로 급성 폐손상 및 성인형 호흡곤란 증후군에서 중요한 역할을 하는 IFNγ, TNFα, 내독소 등으로 백서 폐미세혈관 내피세포를 자극시 NO 생성이 증가하고 미토콘드리아 aconitase 활성도가 유의하게 감소되며 이 NO 생성과 미토콘드리아 aconitase 활성도 억제가: L-NMMA-병용 투여로 유의하게 저지되는 등 백서 폐미세혈관 내피세포에서 NO 다량 생성의 유도가 가능하고 이때의 혈관 내피세포 미토콘드리아 aconitase 활성도 억제가 NO 생성과 관련됨을 확인하였다. NO의 과다생성을 L-NMMA로 억제했을 때 미토콘드리아 aconitase 활성도 억제가 저지되는 것은 NOS 길항제의 긍정적 효과의 하나로 내독소 쇼크와 체손상에서 치료제로서 NOS 길항제의 응용 가능성을 보다 적극적으로 검토할 필요가 있다.

[영문]

Nitric oxide(NO) is the endothelium-derived relaxing factor which is an important messenger in the physiologic regulation of vascular and nervous systems. There are both constitutive and inducible forms of nitric oxide synthase in the endothelial cells. In the acute lung injury and the adult respiratory distress syndrome, the endotoxemia is one of the most important causes; cytokines, such as interferonγ (IFNγ) and tumor necrosis factorα(TNFα), are released in large amounts; TMFα is

the important cause of the cell injury. The combination and the amount of stimulating agents for inducible nitric oxide synthase(iNOS) are different in the various cells depending on the source of organ and species. Because NO reacts well with iron, it may affect the activity of enzymes, such as mitochondrial aconitase, which contain iron-sulfur structure as a prosthetic group.

The effect of treatment with IFNγ, TNFα, lipopolysaccaride(LPS) and NOS inhibitor, N-monomethyl-L-arginine(NMMA) on the production of NO and its relationship to mitochondrial aconitase activity were studied in cultured rat lung microvascular endothelial cells(RLMVC). The results were as below:

1. There were no measurable amount of nitrite in the RLMVC culture media until 45 hours with stimulation by single agent of INFγ 250 U/ml or 500 U/ml, TNFα 150 U/ml or 300 U/ml and LPS 5㎍/ml or 10 ㎍/ml.

2. Nitrite was measurable from 12 hours and it was increased to 49 hours on the combined stimulation of 2 or 3 agents. At 24 hours, nitrite was the most increased in INFγ 500 U/ml, TNFα 300 U/ml and LPS 5 ㎍/ml which was significantly higher compared with combinations containing 0 or 250 U/ml of INFγ, or none of LPS.

3. The nitrite level(mean±S.D.: n=4) was 3±0.5μM in the group of INFγ 500 U/ml, TNFα 300 U/ml, LPS 5 ㎍/ml and NMMA 0.5 mM which was significantly blocked, compared with 27± 1.0μM in the group of INFγ 500 U/ml, TNFα 300 U/ml and LPS 5 ㎍/ml(n=4; P<0.05).

4. The mitochondrial aconitase activity was 102±34 nmole/min/mg of protein in the group of INFγ 500 U/ml, TNFα 300 U/ml and LPS 5 ㎍/ml which was significantly lower than the values of 196±8 nmole/min/mg of protein in control and 161±24

nrnole/min/mg of protein in the group of INFγ 500 U/ml, TNFα 370 U/ml, LPS 5 ㎍ /ml and NMMA 0.5 mM(n=4; P<0.05).

In conclusion it was possible to prevent the suppression of mitochondrial aconitase activity with NOS inhibitor in the RLMVC stimulated by INFγ, TNFα, and LPS. It suggests that the excessive production of NO from the endothelial cells, in

response to cytokines and endotoxin, could inhibit the function of the endothelial cell itself.