ATP-citrate lyase 유전자의 promoter내 조절부위 분석

Abstract

[한글]

ATP-citrate Iyase(ACL)는 지방의 생합성 과정에서 acetyl CoA를 공급해주는 데 중요한 역할을 하는 효소이다. 간장조직이나 지방조직에서는 식이조절이나 여러 호르몬 처치에 따라 이 효소의 농도가 극적으로 변화된다. 백서를 하루나 이틀간 굶기면, 간장에서 ACL 효소 합성율이 감소되지만, 고함수탄소가 함유된 식이를 투여하면 효소의 생합성이 증가된다. 고함수탄소 식이에 의한 ACL 유전자 발현 증가에 직접적으로 관여하는 인자로서 insulin과 포도당(흑은 그 대사산물)을 생각해 왔었다. 생체에서 고함수탄소 식이 후에 변화되는 많은 인자들 중에 ACL 유전자 발현에 관여하는 주된 인자를 찾는다는 것이 불가능하기 때문에, 본 연구에서는 간장세포를 일차 배양한 다음 포도당과 insulin 농도 변화에 따른 ACL 및 ACL mRNA의 양적 변화를 관찰하였다. ACL의 농도는 5mM 포도당 농도에서 보다 25mM과 5OmM 포도당 농도에서 현저히 증가되었으며, 이러한 현상은 insulin 없이도 일어나며, insulin이 존재할 경우 ACL농도 증가가 더욱 현저하였다. 이러한 효소의 양적 변화는 ACL mRNA의 양적 변화와 일치하였다. 이상의 결과는 ACL 생합성을 증가시키는 주된 인자는 포도당이며, insulin은 포도당의효과를 증폭시켜주는 역할을 한다는 것을 시사한

다.

ACL promoter -485에서 -512의 염기서열은 S14 유전자의 carbohydrate response element(ChoRE)의 consensus sequence를 포함하여 주변의 염기서열과 높은 상동성을 보이며, gel retardation 분석실험에서 ACL promoter의 -625예서 -373의 염기서열이 S14 유전자의 ChoRE와 간장 핵 단백질과의 결합을 특이하게 억제함을 보였다. 그러나 일차 배양백서 간장세포에서 transient transfection 실험 결과 보존된 ChoRE 부위를 함유한 ACL promoter-CAT construct들 [pNP82-CAT(-624 to -1), pNP62-CAT(-947 to -1),pNP21-CAT(-1723 to -1), pXP-CAT(-2370 to -1)]에서 고농도 포도당에 의하여 chloramphenicol acetyltransferase(CAT) 활성이 증가되지 않았으며, 유독 pNP33-CAT(-1342에서 -1)에서만 CAT 활성이 2.64배 증가되었다. 이러한 사실로 미루어 포도당에 의한 ACL 유전자 발현 증가는 한 개의

짧은 염기서열 요소만으로 이루어지는 단순한 기전에 의한 것이 아니라 여러 염기서열 부위에 많은 trans-acting factor들이 함께 작용하여 나타나는 복잡한 기전에 의해 일어나는 현상으로 사료된다.

CHO 세포, HepG2 세포, 일차 배양 간장세포에서 ACL Promoter-CAT construct들간에 CAT 유전자 발현 정도를 비교하였다. 다수의 Spl 결합부위가 존재하는 -1에서 -419까지의 염기서열에는 모든 실험 세포에서 유전자 전사를 증가시키는 강한 enhancer가 함유되어 있

는데, -114에서 -300까지, -349에서 -419까지의 염기서열부위가 유전자 전사를 증가시키는 역할을 하였다. -419에서 -1723까지의 부위에는 유전자 발현을 억제하는 silencer 역할을 하는 다수의 부위가 존재하며, -1723에서 -2370까지의 부위는 -419에서 -1723까지의 silencer 부위에 의하여 감소된 유전자 발현을 회복시키는 enhancer가 존재하였다.

[영문]

ATP-citrate Iyase(ACL) plays an important role in supplying the acetyl CoA for de novo lipogenesis. The concentrations of ACL in the liver and adipose tissue dramatically changes when animals are subjected to different nutritional and hormonal manipulations. When rats are fasted for 1 to 2 days, the rate of synthesis of ACL declines, and refeeding a high-carbohydrate diet increases the synthesis of this enzyme. It has been suggested that insulin and glucose metabolites are the factors involved in the increase of ACL gene expression by high-carbohydrate diet.

However, in vivo, it is impossible to discriminate which of the various factors chanced by refeeding a high-carbohydrate diet play the major role in the induction of ACL. In this study, the change of concentration of ACL and its mRNA according to the various concentration of glucose and insulin were observed in the primary hepatocyte culture. The concentration of ACL was increased by 25mM and 50mM glucose when compared with 10mM lactate and 5mM glucose, and these in-creases by glucose were augmented by 0.1U/ml insulin. The changes of the amounts of ACL mRNA corresponded to changes of ACL contents. These results suggest that the primary factor involved in the induction of this enzyme by refeeding high-carbohydrate diet is glucose(or its metabolite) and the action of insulin is only to augment the

effects of the 91ucose. The sequences from -485 to -512 of the ACL promoter are highly homologous to the sequences surrounding the carbohydrate response element(ChoRE) of the 514 gene which activates the expression responding to glucose. The 9el retardation analysis skewed that the ChoRE-conserved sequence of

ACL promoter specifically inhibited the formation of the complex between the ChoRE of 514gene and the nuclear proteins isolated from rat liver. However, in transient expression assay, the most ACL promoter-CAT constructs containing ChoRE-conserved sequence [pNP82-CAT(-524 to-1), pNP62-CAT(-947 to -1), pNP21-CAT(-1723 to -1), pXP-CAT(-2370 to -1)] did not show the activation by glucose, except pNP33-CAT(-1342 to -1), which showed 2.64 fold increase in chloramphenicol acetyltransferase(CAT) activity by high concentration of glucose. The activation of ACL gene expression by glucose seems to be regulated in very complicated manner involving the interactions between the contexts of the several sequence elements and various tarns-acting factors, not a simple mechanism directed only by a short sequence element.

To compare the expression of CAT gene among ACL promoter-CAT constructs in CHO cell, Hep72 and primary culture of hepatocyte, a series of the constructs have been introduced into the cells and CAT activities have been assayed. The proximal promoter region(-419 to -1) containing several Spl binding sites contains the strong enhancer which increases the transcription of CAT gene in the various cell lines. The legions of -3O0 to -114 and -419 to -349 were considered to be involved in enhancing the expression. The region from -1723 to -419 decreases efficiency of

the ACL promoter. The distal region from -2370 to -1723 contains the enhancer re-covering the expression decreased by the extinguisher region (-1723 to -419).