가토 관상동맥에서 세포내 calcium 저장소로부터 calcium 유리 기전의 특성

Abstract

[한글]

혈관 평활근 세포의 수축은 세포내 유리 Ca**2+ 농도의 증가에 의해 유발된다. 따라서 세포내 유리 Ca**2+ 농도의 조절이 수축단백질의 Ca**2+ 에 대한 감수성 조절과 함께 혈관 평활근의 수축을 조절하는 방법중의 하나이다. 혈관 평활근의 수축을 유발하기 위해 필요한 C**2+ 은 세포외액으로부터의 유입이나 세포내 C**2+ 저장소로 부터의 유리에 의해 동원될 수 있다. 그러나 이러한 두가지의 Ca**2+ 근원중 혈관 수축에 있어서 상대적인 중요도는 아직 자세히 밝혀져 있지 않으나 적어도 세포내 Ca**2+ 저장소로부터 유리되는 Ca**2+ 이 혈관 평활근의 수축을 유발하는데 중요한 역할을 할 것이라는 것은 명백하다.

그러므로 세포내 Ca**2+ 저장소의 특성과 그것의 Ca**2+ 유리 기전을 상세히 규명할 필요성이 있다.

따라서 본 실험에서는 가토 관상동맥을 β-escin으로 처치하여 투과성 있는 관상동맥을 만들어 여러가지 실험 조건에서 장력을 측정함으로서 평활근 세포내 Ca**2+ 유리의 기전으로 Ca**2+ -indiced Ca**2+ release(CICR)와 IP^^3 -induced Ca**2+ release(lICR) 기

전의 존재, 특성 및 분포정도를 관찰하여 가토 관상동래의 세포내 Ca**2+ 저장소로부터 Ca**2+ 유리 기전을 규명하고, 관상동맥의 수축제인 acetylcholine을 사용하여 β-escin 처치시 세포막에 G protein/phospholipase C/IP^^3 cascade의 존재여부를 규명하고자 실

험하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 관상동맥환을 30μM β-escin을 40분간 처치하였을 경우 외부 Ca**2+ 용액에 대한 민감도가β-escin을 처치하지 않는 관상동맥에서 보다 현저히 높음을 알 수 있었고, IP^^3를 처치하였을 경우 관상동맥의 수축이 관찰되었다.

2. β-escin이 처치된 관상동맥에 caffeine을 처치하였을 경우 일시적인 수축이 나타남을 알수 있었고, IP^^3 를 처치하였을 경우 caffeine에 비해 수축고의 크기는 작지만 빠른 수축후에 서서히 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.

3. lICR의 specific inhibitor로 알려진 heparin은 IP^^3 에 의한 혈관 수축을 억제시켰으나 caffeine에 의한 수축은 억제시키지 않았다. 반면에 CICR의 specific inhibitor로 알려진 procaine은 IP^^3 에 의한 혈관 수축은 억제시키지 않았으나 caffeine에 의한 수

축은 억제시켰다. 한편 ryanodine은 IP^^3 와 caffeine에 의한 혈관 수축을 모두 억제시켰다.

4. Caffeine으로 CICR을 최대로 자극했을 때 발생되는 장력은 IP^^3 로 lICR을 최대로 자극했을 때 발생되는 장력에 비해 크게 나타났다. 또한 caffeine으로 CICR을 최대로 자극한 후Ca**2+ 의 재축적없이 IP^^3+ 로 lICR을 최대로 자극하였을 경우 더 이상의 수축은 유발되지 않았으나, lICR을 최대로 자극한 후 CICR을 활성화하였을 경우 여전히 수축은 유발되었다. 이 때 caffeine에 의한 수축의 크기는 caffeine단독 처치 때 보다 작았고, IP^^3와 caffeine에 의한 수축의 합은 caffeine 단독 처치시와 유사하였다.

5. Acetylcholine 단독은 매우 작은 혈관 수축을 유발하였으나 이러한 수축의 크기는0.1mM GTP에 의해 증가되었다. 한편, acetylcholine에 의한 혈관 수축은 heparin에 의해 완전히 억제되었으나, procaine에 의해서는 억제되지 않았다.

이상의 실험 결과로 볼 때 가토 관상동맥 평활근 세포는 두 종류의 Ca**2+ 유리 기전 즉, CICR와 lICR가 존재하는 것으로 생각되고, CICR 기전은 전체 세포내 Ca**2+ 저장소막에 존재하며 lICR 기전은 일부의 세포내 Ca**2+ 저장소막에 존재하는 것으로 추측된다 또한 β-escin을 처치한 관상동맥의 세포막에는 G protein/phospholipase C/IP^^3 cascade가 여전히 존재하는 것으로 추측되고, lICR로부터의 Ca**2+ 유리가 acetylcholine에 의한 수축의 기전중 일부로 작용할 것이라 추측된다.

[영문]

Physiological contraction of vascular smooth muscle cells is mediated by an elevated intracellular free Ca**2- concentraction. Therefore, control of the cytoplasmic Ca**2+ concentration is one of the major ways to regulate the strength of vascular smooth muscle contraction together with control of the sensitivity of

the contractile system to Ca**2+ The Ca**2+ to activate the contractile tracellular Ca**2+ store. While the relative importance of these two Ca**2+ sources in various types of contraction has not been precisely determined, it is clear that the least under certain circumstances Ca**2+ released from the intracellular Ca**2- store plays a major role to evoke contraction of smooth muscle cells. It is important to know, therefore, about the detailed properties of the Ca**2+ store and its Ca**2+ release mechanism.

To elucidate the Ca**2- release mechanisms by using β-escin permeabilized rabbit coronary artery, changes in tension were measured under varying experimental condition. Furthermore, we investigated properties and distribution of two kinds of Ca**2+ release mechanisms, Ca**2+ -induced Ca**2+ release (CICR) and IP^^3 -induced Ca**2+ release (lICR).

The results obtained were summarized as follows;

1. When rabbit coronary artery were incubated in relaxing solution containing 30μM β-escin for 40min, sensitivity to externally added Ca**2+ was much higher in β-escin permeabilized muscle than in intact preparations and the contractile effect of IP^^3 in β-escin permeabilized muscle was demonstrated.

2. Caffeine and IP^^3 contracted rabbit coronary artery permeabilized with β-escin, but amplitude of contraction was much larger in caffeine than in IP^^3.

3. Intracellular heparin, a specific inhibitor of lICR, completely inhibited the contractions induced by IP^^3, but not those by caffeine. On the other hand, procaine, a specific inhibitor CICR, inhibited the responses to caffeine, but not

those to IP^^3, Ryanodine, locks Ca**2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum(SR) in an open state and depletes Ca**2+ stored in the SR, inhibited the caffeine- and IP^^3-induced contraction.

4. Amplitude of contraction was much larger in the maximal stimulation of CICR by applying caffeine than in the maximal stimulation of lICR by applying IP^^3. After the maximal CICR stimulation by caffeine, the activation of lICR by IP^^3 without

reloading of Ca**2+ could no longer evoke contraction. On the other hand, after the maximal lICE activation, the activation of CICR could still evoke contraction although the amplitude of contraction was smaller compared with the case without initial lICR stimulation.

5. Acetylcholine contracted coronary artery smooth muscle permeabilifed with β-escin. However, in the absence of added GTP, the responses were very small. Acetylcholine-induced contraction inhibited by heparin, but not by procaine.

From the abode results, it may be concluded that there are two kinds of mechanisms of Ca**2+ release, CICR and lICR, in rabbit coronary artery smooth muscle cell and the CICR mechanism distributes on the membrane of the whole smooth muscle Ca**2 store, but the lICR mechanism does only on a part of it. And it may be that the coronary arteries permeabilized by β-escin retain the G protein/phospholipase C,/IP^^3 cascade and the Ca**2- release from intracellular Ca**2+ store, through lICR mechanism, is a major mechanism for acetylcholine-induced contraction.