중합효소 연쇄반응을 이용한 가검물내 결핵균의 검출 및 동정

Abstract

[한글]

결핵의 진단은 환자의 임상증상 및 X-선소견과 아울러 가검물에서 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 분리하여 확진한다. 그러나 가검물에서 결핵균을 분리하여 동정하기가지는 4∼8주간의 시일이 소요되며 민감도에 있어서도 미흡한 점이 있어 화학요법치료의 지연을 초래하게된다. 최근 분자생물학기법의 발달로 DNA의 특정부분을 시험관내에서 증폭하여 검출하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)법이 개발되었으며, PCR을 이용하여 결핵균 DNA를 특이성과 민감도가 높으며, 신속하게 검출할 수 있는 방법이 보고되었다. 그러나 환자나 건강대조군의 가검물을 대상으로 PCR을 시행하여 결핵의 진단이나 환자의 치료 후 관리에 응용한 보고가 없어 실제로 임상에서 PCR을 이용한 결핵 진단의 가능성은 아직 알려지고 있지 않다.

따라서 본 연구에서는 M. tuberculosis complex에 속하는 mycobacteria의 DNA에 10-16곳에 존재하는 Is6110 repetitive sequence에 근거한 123bp 단편을 증폭하는 PCR법을 이용하여 폐결핵환자 및 기타 호흡기 질환 환자의 가검물에서의 PCR 결과와 환자의 임상관찰과 배양결과를 비교하여 결핵의 진단에 PCR의 응용가능성을 평가하고자 하였으며, 그 결과는 다음과 같다.

1. 결핵균을 포함한 4종의 mycobacteria 및 기타 세균의 DNA를 분리하여 PCR을 시행한 결과 Is6110 DNA의 123bp 단편이 M. tuberculosis complex에 속하는 mycobacteria에서만 증폭되어 본 연구에서 이용한 primer에 의한 PCR이 결핵균을 특이하게 검출할 수 있음을 보였다.

2. 가검물에서 검출되는 123bp DNA산물과 결핵균 DNA에서 PCR을 이용하여 증폭한123bp를 (32)**P 로 표지하여 DNA hybridization을 시행한 결과 가검물에서 증폭되는 123bp가결핵균 DNA의 123bp와 일치함을 보여 가검물에 결핵균이 존재함을 알 수 있었다.

3. 가검물에 존재하는 결핵균 DNA를 분리하는 방법으로 bead-beating법, Iysozyme-sodium dodecyl sulfate-Geneclean법, 및 proteinase K법을 32개의 가검물을 대상으로 비교한 결과 검출률은 각각 90.6%, 90.6%, 84.4%로서, 민감도와 소요시간 및 간편성을 비교할 때 bead-beating법이 가장 우수하였다.

4. 가검물내의 결핵균 수를 산정한 후 10배수 계단 희석하여 bead-beating법으로 DNA를 분리하고 PCR을 시행한 결과 균수가 1∼10인 경우에도 증폭된 DNA를 관찰할 수 있었다.

5. 가검물을 대상으로 PCR을 시행한 결과 정상대조군 17명의 객담에서는 모두 PCR 음성이어서 본 연구에서 시행한 PCR의 특이도가 매우 높음을 알 수 있었다. 한편 활동성 폐결핵환자로 진단되어 치료중인 환자 117명 중 93명(79.5%)의 가검물에서 PCR법으로 결핵균

DNA 단편을 검출할 수 있었다. 이는 도말검사나 배양검사에 의한 결핵균 검출률 53.8%(117명 중 63명)보다 유의성 있게 높아 PCR법이 배양검사보다도 민감도가 높음을 알 수 있었다.

6. 비활동성 폐결핵 경력자중 재발이 의심되어 내원한 41명의 배양검사 음성인 가검물 중 16명(39%)에서 PCR법으로 결핵균 DNA를 검출할 수 있었다.

7. 결핵 이외의 호흡기 질환으로 내원한 환자의 가검물에서 PCR을 시행해본 결과 30명가운데 14명(46.7%)에서 PCR에 의해 결핵균 DNA가 검출되었으나 이들에 대한 임상 관찰 결과는 앞으로 추시해야 할 것으로 사료된다.

이상의 결과로 보아 결핵균에 특이하게 존재하는 Is6110 repetitive sequence에서 123bp DNA 단편을 증폭하는 PCR법은 임상 가검물에 존재하는 결핵균 DNA를 신속하고 특이하게 검출할 수 있으며, 민감도에 있어서도 결핵균 배양법보다 우수하여 PCR법이 결핵균의 실

험실진단방법으로 이용될 가능성을 보였다. 그러나 PCR법은 생존한 결핵균과 사멸한 것의 구별을 못하는 단점이 있으며, 미량의 결핵균의 존재와 임상증상의 발현과의 명확한 관계가 정리되지 않은 상태에서 PCR 결과를 결핵의 진단이나 환자의 치료 후 관리에 응용하기 위해서는 보다 많은 전향적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.

[영문]

Recent development in the polymerase chain reaction(PCR) technology has brought an extraordinary opportunity for the rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens for the diagnosis of tuberculosis. DNA segment which is specific to M. tuberculosis was detectable in matter of hours and DNA from one to 10 organisms appeared positive by PCR. However, the PCR tools have not been evaluated using clinical specimens from tuberculosis patients and controls. Even DNA preparation methods have net been clearly eatablished. This study was, therefore, initiated to explore the efficient M. tuberculosis DNA preparation methods from clinical specimens and to evaluate the PCR tools for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. The primers amplifying the 123 bp segment of the IS6110 repetitive sequence of the M. tuberculosis DNA were used in PCR. Clinical specimens from the active pulmonary tuberculosis patients, inactive cases and controls were examined for the presence of M. tuberculosis DNA by PCR and the results were then compared with bacteriological and clinical findings.

The results obtained were as follows:

1. As a result of PCR after DNA preparation of M. tuberculosis, three other mycobacteria and other bacteria, the 123 bp DNA fragment based on Is6110 was amplified specifically from M. tuberculosis complex. PCR thus was a useful method for the detection of M. tuberculosis.

2. Dot blot hybridization of PCR products from clinical specimens with (32)**P-labeled 123 bp DNA fragments Prepared from M. tuberculosis chromosomal DNA as a probe showed a positive reaction. This indicated that m. tuberculosis were present in the clinical specimens.

3. When the M. tuberculosis DNA from clinical specimens were isolated by bead-beating, Iysozyme-sodium dodecyl sulfate-Geneclean and proteinase K method, the detection rates were 97.6%,90.6% and 84.4%, respectively and the bead-beating method gave the best sensitivity and rapidity.

4. As the results performed PCR after DNA isolation by bead-beating method, the sensitivity was one to ten organisms of M. tuberculosis.

5. Clinical samples from 211 patients presented to the chest clinic at a teaching hospital and 17 samples from normal controls were examined for the presence of m. tuberculosis DNA by PCR and the results were then compared with bacteriological and clinical findings of patients and controls. None of normal controls were PCR positive, thus indicating the high specificity of PCR. Of 117 patients with active pulmonary tuberculosis,93(79.5%) were PCR positive; in contrast, only 63(53.9% ) were culture positive.

6. Sixteen(39% ) of 41 inactive pulmonary tuberculosis with culture negative who were suspected having reinfection had detectable m. tuberculosis DNA by PCR.

7. Fourteen(46.7% ) Patients with 30 Pulmonary diseases without tuberculosis had detectable M. tuberculosis DNA by PCR, but it is necessary to perform follow-up study on these patients.

These results thus showed that the PCR method amplifying the 123 bp fragment was highly sensitive and specific in detecting the M. tuberculosis DNA in clinical specimens; however, the significance of PCR positive results remains to be determined in terms of detecting active pulmonary tuberculosis patients, particularly in the endemic areas of tuberculosis