인삼 Saponin 성분이 사람적혈구에서의 Donnan Ratio에 미치는 영향

Abstract

[한글]

생리학적인 조건에서 적혈구세포와 혈장 사이에 chloride ion(Cl**- )의 분포는 Donnan평형을 이루고 있다는 사실은 여러 연구자들에 의해 보고 되었다(Warburg, 1922; Van Slyke등, 1923; Dill등, 1937: Fitzsimons 및 Sendroy, 1961: Davson, 1959; Bromberg등, 1965). 이와같이 세포막을 경계로 이루어지는 Cl**- 평형분포 또는 Donnan's ratio([Cl**-]^^i / [Cl**-]^^o )는 세포내에만 존재하는 비투과성분자(impermeant molecules)들의 농도와 이들 분자들의 하전(charge)수에 의하여 결정된다. 적혈구의 경우에 있어서 Cl**-

평형분포에 영향을 미치는 비투과성분자들은 주로 혈색소(Hb), 2,3 diphosphoglycerate (2,3-DPG) 및 adenosine triphosphate(ATP)들이다. 그러므로 어떤 이유로든지 비투과성분자들(2,3-DPG, ATP)의 하전에 변화를 일으키는 인자들은 모두 Cl**- 의 평형분포에 영향을 미칠 수 있다. 예를들면 ① 적혈구 세포내의 proton에 의한 적정 (titration) 단백질 구조의 변화 ③ 2,3-DPG와 혈색소와의 결합반응에 변화가 초래되는 경우 등이다.

강(1983)은 인삼 saponin 성분이 적혈구세포 해당과정의 중간산물에 미치는 일련의 실험에서인삼 saponin 은 ATP와 pyruvate의 농도를 증가시키고 adenosine diphosphate의 농도는 감소시키나 lactic acid 생산량에는 별 영향을 미치지 않았다고 보고하였다. 또한 인삼 saponin성분이 생체막에 미치는 효과를 보면 정 및 강(1976)은 lysosome 막의 투과도를 증가시킨다고 시사하였으며, 홍(1973)은 인삼 saponin은 적혈구의 삼투적 및 기계적 충격에 대하여 세포막을 보호하는 작용이 있음을 보고하였으며, 이 와 강(1978)은 인삼 saponin 은 reseated 적혈구에서 Na**+ efflux를 증가시킨다고 보고하였다.

따라서 본 실험에 인삼 saponin성분이 적혈구세포내 organic phosphate의 농도에 변화를 일으키는 것으로 보아 ① 적혈구막을 경계로 유지되는 Cl**- 평형분포에도 영향을 미치는지 여부를 규명하고, 적혈구세포내에 존재하는 2,3-DPG를 감소시킨 적혈구(2,3-DPG depleted redcells)에서 Cl**- 평형분포 양상을 관찰하고, ③ 적혈구는 Cl**- 뿐 아니라 수소이온(H**+ )에 대해서도 Donnan 평형을 유지하고 있으므로 세포외액의 pH를 달리하였을때 인삼 saponin이 Cl**- 평형분포비 미치는 영향을 관찰하고, Donnan (r)**Cl 와 세포외액의 pH로부터 세포내 pH를 계산하여 인삼 saponin 성분이 세포내 pH에 미치는 영향을 관찰하고 ④ 인삼 saponin 성분이 적혈구막을 통한 chloride transport에 어떤 영향을 미치는지를 규명코져 본실험을 시행하였다.

① 건강한 성인의 신선한 혈액을 실험재료로 하여 원심침전법에 준하여 packed cell을 분리한후, incubation medium을 가하여 적혈구세포 부유액을 만들어 (36)**Cl 을 첨가하여 대조군과 실험군(인삼 saponin 투여군)으로 나누어 37℃에서 3시간 incubation한 후 각각의 Hct를 측정하고, 적혈구세포 부유액 1ml와 적혈구세포 부유액 1ml에 6% perchloric acid(PCA) 1ml을 첨가, 이들을 원심침전하여 상층액을 분리, 세포외액 및 적혈구 부유액 전체의 균질액에서 (36)**Cl 의 방사능을 각각 측정하여 Reeve(1976)가 유도한 공식에 준하여 Donnan (r)**Cl을 계산하였다.

② 2,3-DPG가 감소된 적혈구는 적혈구세포 부유액을 36℃에서 16시간 incubation하여 얻은 적혈구 세포부유액을 이용하여 상기한 방법에 준하여 대조군과 실험군으로 나누어 Donnan (r)**Cl 을 측정하였다.

③ HCI 또는 NaOH을 적혈구세포 부유액에 첨가하여 세포외액의 pH를 6.8, 7.4 및 8.0으로 조절하고 상기한 방법에 준하여 대조군과 실험군에서의 Donnan (r)**Cl 을 측정하였고, Donnan (r)**Cl 와 세포외액 pH로부터 세포내 pH를 계산하여 인삼 saponin이 세포내 pH

에 미치는 영향도 관찰하였다.

Chloride efflux rate는 (36)**Cl -loaded cell을 0℃로 냉각된 chloride flux medium에 가하고, Millipore Swinnex filtration technique에 준하여 상층액을 분리하였고, 한편 적혈구세포 부유액에 6% PCA를 가하여 원심침 전하고, 각각의 상층액에 scintillation

Cocktail을 가하여 (36)**Cl 의 방사능을 측정하여 (36)**Cl 의 efflux rate를 계산하였다. 이때 실험군에는 인삼 saponin을 첨가하여 대조군의 것과 비교하였다. 또 적혈군막의 anion 투과도를 억제시키는 약물 4, 4'-diisothiocyano-stilbene-2, 2'-disulfonic acid (DIDS)투여시의 chloride efflux rate를 측정하여 대조군 및 saponin 투여시에 측정한 chloride efflux rate의 값과 비교하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1) 사람의 정상적혈구에서 Donnan (r)**Cl 는 인삼 saponin 성분의 농도가 증가됨에 따라 대조군의 값에 비하여 증가되었으며 이와같은 증가는 통계학적으로 의의있는 차이었다.

2) 2,3-DPG depleted red cells에서 Donnan (r)**Cl는 정상적혈구 Donnan (r)**Cl 에 비하여 높았으며, 인삼 saponin 성분을 투여함에 따라 Donnan (r)**Cl 는 더욱 증가되었으며, 이와같은 증가는 통계학적으로 의의있는 차이었다.

3) 세포외액의 pH를 6.8, 7.4 및 8.0으로 산성 pH에서 알칼리성 pH로 증가시킴에 따라 대조군과 실험군에서의 Donnan (r)**Cl 는 모두 감소되었다. 동일한 pH에서 Donnan (r)**Cl 는 인삼 stoponin 투여시에 높게 유지되어 있었으며, saponin 을 투여함으로서 세포내

pH는 알칼리 쪽으로 이동되었다.

4) 인삼 saponin성분은 (36)**C 의 efflux rate 를 감소시켰으며, 감소정도는 인삼 saponin 농도에 비례하였으며, 그 감소정도는 DIDS 투여시의 값과 유사하였다.

이상의 실험결과를 미루어 인삼 saponin 성분은 사람적혈구에사 Donnan'Cl을 증가시키는데 이는 아마도 ① 세포내 pH를 변화시키고, 세포내 2,3-DPG 농도를 감소시키므로서 나타나는 결과가 아닌가 생각되며, 인삼 saponin 성분에 의한 (36)**Cl 의 efflux rate의

감소는 인삼 saponin 성분이 적혈구막에 존재하는 chlocride transport site에 영향을 미치므로서 나타난 것으로 생각된다.

[영문]

The erythrocytes is in Donnan equilibrium with reapect to all permeant ions. Therefore, the distributions of those ions across the membrane is related to the concentration and net change of the impermeant species inaide the erythrocyte. In erythroytes, these impermeant ions are principally hemoglobin(Hb), 2,3-diphosphoglyceric acid(2,3-DPG), and adenosine triphosphate (ATP). Thus any alterations in concentrations and charges of these molecules, either by hydrogen ion titration, 2'3-DPG and Hb reaction or conformational change will be directly reflected in the distribution of anions, i.e., a change in the Donnan equilibrium. Quite recently Kang(1983) reported that saponin extracted from Panax Ginseng on erythrocyte metabolism elevated cellular ATP, pyruvate and deoreased adenosine diphoaphate. Lactate production were little affected by saponin. Many invesgators also reported that saponin altered the membrane permeability(Chung, 1971; Chung and Kang, 1976: Paik et at., 1976; Lee and Kang, 1978).

Therefore, the aim of the present investigation was to evaluate the effect of saponin on the Donnan equilibrium and chloride efflux in the human erythrocytes.

In the first series of experiment, fresh blood was collected from healthy volunteers in heparinized vacutainers and the erythrocytes separated by centrifugation at 10,000 x g for 1 minute. The cells were washed 4 times with incubation medium. The cells were then resuspended at a hematocrit of 20% in the incubation medium and the cells incubated at 37℃ water bath, stirred, for 3 hrs. At the end of incubation, both one ml of each of the whole suspension placed in an equal volume of 6% PCA for deproteinization and one ml of cell dudpendion were centrifuged at 10,000×9 for 1 minutes. After centrifugation. 7.5 ml of each

supernatant was added to 9.5 ml of scintillation cocktail and counted radioactivity with Liquid Scintillation Spectrometry. Donnan chloride ratio was computed according to Reeves(1976). In the second series of experiment, Donnan rCl was measures at different concentration of saponin with 2,3-DPG depleted red cells. To deplete 2,3-DPG, wasted erythrocytes were suspended in a medium containing 0.1 mg% chloramphenicol and incubated without added substrate at 37℃ for 16 hrs and then 2,3-DPG were measured. In this manner, 2,3-DPG concentrationa were depleted to lese than one-fourth of that in fresh cells. In third series of experiment, the pH of red cell suspension was adjuated to the appropriate pH by the addition of HCl or NaOH and then Donnan rCl was measured.

For chloride efflux measurement, cells were wasted 3 times in Cl-flux medium and the cells were incubated in the medium containing (36)**Cl for 20 min at 25℃ and then for an additional 5 min at 0℃. The suspension was then centrifuged and the radioactive supernatant removed.

The unwashed packed cells were added to 0℃ Cl-flux medium, magnetically stirred.

Supernatant samples were taken after mixing by means of a rapid filtering technique (Wieth et at., 1973).

Efflux of trace anions, 1n(1-Pt/P_), is plotted against time. The rate constant (time**-1 ) for Cl-efflux (.1) were taken as the slopes of these lints. The results obtained are summarized as follows :

1. By increasing saponin concentration from 0 to 5, 10, 15 and 20 mg%, Donnan (r)**Cl change significantcy from control value of 0.674 to 0.672, 0.741, 7.847 and 0.828 respectively. At 5 mg% of saponin concentration, Donnan rCl was unchanged.

2. By reducing the 2,3-DPG concentration of the red cell, the value of Donnan rCl increased to 0,904 from control value of normal red cell 0.672. Even in 2,3-D7G depleted red cells, increasing concentration of saponin resulted in an increase in

the Donnan rCl from 0.904 to 1.325 at 20 mg% of saponin. These results suggest that 2,3-DPG concentration in red blood cells are further reduced by saponin.

3. When extracellular pH is increased from 6.8 to 8.01 the Donnan rCl decreased from 0.911 to 0.574 in control and from 1.192 to 0.902 at 20mg% of saponin. The line was parallel to control, but it was shifted upward. At any given extra cellular pH, the intracellular pH was more alkaline at 20 mg% of saponin than control except very high pH**E .

4. Efflux rate of chloride were significantly inhibited by saponin and the degree of inhibition was dependent on the saponin concentration. The inhibitory effect of saponin was almost same as exposed to DIDS. If albumin was added prior to DIDS or saponin the inhibition of chloride transport was prevented. These results suggest that saponin may react with Cltransport site of the erythrocyte membrane.