단세포군 항체를 이용한 간흡충 항원의 분석 및 간흡충증의 진단

Abstract

[한글]

우리 나라의 중요한 인체 기생충인 간흡충(Clonorchis sinensis)을 연구함에 있어, 단세포군 항체 제조법을 이용하여 보았다.

간흡충의 성충 조(粗)항원으로 면역한 마우스의 비장 림프구와 형질세포종(plasmacystoma)세포를 융합하여 간흡충의 항원에 대한 단세포군 항체를 분비하는 융합 세포를 만들었다. 이 융합세포로부터 간흡충 항원에 대한 특이 단세포군 항체를 얻어, 이의 특성 및 반응하는 항원의 특성을 분석하고, 아울러 ELISA 억제 검사법을 이용하여 면역 진단법 상 특이도의 개선을 모색하였다.

그 결과, 간흡충 항원에 대한 항체를 분비하는 총 29개의 융합세포군을 확인하였는데,이 중 8개는 다른 기생충 항원에 대해 교차 반응을 나타내지 않는 높은 특이성을 지니고 있었다. 클로닝 후 선택된 6종류의 단세포군 항체는 Ig Gl이 넷이었고, 나머지는 Ig G2b

및 Ig A로 나타났다.

위와 같이 선택된 단세포군 항체 중 4 개 만이 자연 감염 시에도 표현되는 항원 결정기에 대하여 생성된 것으로 판단되었다. 효소 면역 전기영동 블로팅으로 분자량 10KD, 34 KD 항원은 각각 CsHyb 0714-20 및 CsHyb 0605-10 단세포군 항체와 항원항체 반응을 나타냄을 확인하였다. 간접 형광항체법을 이용하여 각 항원결정기의 충체 내 위치를 관찰한 결과, CsHyb 0714-20 단세포군 항체에 대한 항원은 충체의 표면 및 실질 대부분에 분포하였으며, CsHyb 0605-10 및 CsHyb 0714-25 단세포군 항체에 대한 항원은 충체의 실질 및 장관의 상피세포에 분포하고 있었다. 한편 CsHyb 0605-23 단세포군 항체에 대한 항원은 주로 자궁내 충란 주위에 많이 분포하고 있었다. 단세포군 항체와 반응하는 Sephadex G 200 젤 여과 항원 분획을 검색한 결과, 검색한 항원 결정기는 모두 전반적으로 빨리 젤 여과

를 통하여 나온 분획에 속하여 있는 것을 알 수 있었다. 네 개의 단세포군 항체와 반응하는 각 항원 결정기는 pronase 및 trypsin에 의해 파괴되어, 단백질 임을 추정할 수 있었다.

한편 이 단세포군 항체를 인체 간흡충증의 진단에 응용하여 그 특이도를 개선하고자 하였다. 통상적인 방법의 ELISA로 시행한 항체가로는 간흡충 감염자의 75%가 양성 범위에 들었으며, 정상 대조군의 7.1%, 폐흡충 감염자의 37.5%가 위양성 반응을 보였다. 반면 CsHyb 0605-23 단세포군 항체를 함께 사용하여 ELISA 억제 검사를 시행한 결과는 간흡충 감염자의 77 1%가 양성으로 판정되었으며, 정상 대조군 및 폐흡충 감염자에서는 양성 반응을 찾아볼 수 없어서 l00%의 특이도를 나타내었다.

[영문]

Clonorchis sinensis is a common parasite of man of which geographical distribution is largely confined to eastern Asia including Japan, China. Taiwan, northern Vietnam and southern Korea. For it causes various pathological changes of the bile duct and surrounding liver tissues, it must be important to carry out immunological study on clonorchiasis. Especially, researches on specific antigens of Clonorchis sinensis would be valuable not only because it can elucidate the characteristics of this fluke but also be applicable to immunodiagnosis.

Monoclonal antibodies having high affinity for a specific antigenic determinant have been recently used to study parasite immunology. But, a few reports on monoclonal antibodies against Clonorchis sinensis have been published so far.

This study aimed to analyze Clonorchis sinensis antigens recognized by monoclonal antibodies and to set up ELISA-inhibition test using Clonorchis sinensis specific monoclonal antibodies for improvement of the specificity of immunodiagnostic tests.

By hybridization between spleen cells of the mice immunized with Clonorchis sinensis water-soluble crude adult worm antigens and plasmacytoma cells of mouce origin, hybridomas secreting anti-clonorchis sinensis monoclonal antibodies were made. Monoclonal antibodies were used for analysis of Clonorchis sinensis antigens and applied to immunodiagnosis of human clonorchiasis.

Twenty-nine hybridoma clones secreting monoclonal antibodies against Clonorchis sinensis antigens were produced. Among them, 8 clones were determined to be specific, and others cross-reactive against various parasite antigens. After cell cloning, isotypes of 6 selected specific monoclonal antibodies were determined to

be 4 kinds of IgGl, IgG2b and IgA.

Four antigenic determinants of natural infection were recognized by specific monoclonal antibodies. By enzyme-immunoelectrotransfer blot, 10 KD, 34 KD antigenic determinants were determined to be reacted with CsHyb 0714-20, CsHyb 0605-10

monoclonal antibodies, respectively. The antigenic determinant recognized by CsHyb 0714-20 monoclonal antibody was revealed to be present at the surface and parenchyme of a fluke and those reacted with CsHyb 0605-10, CsHyb 0714-25 monoclonal antibodies were at the parenchyme and intestines by indirect immunofluorescent antibody technique. The antigenic determinant reacted with CsHyb 0605-23 monoclonal antibody was found mainly around the uterine eggs. Four antigenic determinants recognized by specific monoclonal antibodies were all found to be present in the early eluted fractions of Clonorchis sinensis antigens

separated by Sephadex G 200 gel filtration. The antigenic determinants recognized by monoclonal antibodies were determined to be proteins that could be destructed by treatment with pronase or trypsin.

By conventional ELISA, 75% of clonorchiasis cases were determined to be positive, and 7.1% of normal controls and 37.5% of paragonimiasis cases showed false positives. However, by ELISA-inhibition test using Clonorchis sinensis specific monoclonal antibody (CsHyb 0605-23),77.1% of clonorchiasis cases were determined to be positive. There were no false positive reactions in normal controls or paragonimiasis cases, indications 100% specificity.

In conclusion, using Clonorchis sinensis specific monoclonal antibodies, Clonorchis sinensis antigens were able to be analyzed by various methods. The ELISA-inhibition test was determined to have same sensitivity and definitely high specificity as compared with conventional ELISA test.