자유생활아메바 Naegleria의 단백분해효소와 병원성

Abstract

[한글]

자유생활아메바의 병원성과 단백분해효소 성도와의 상관성을 밝히고자 병원성인 Naegleria fowleri와 비병원성인 N.gruberi 영양형의 용해물과 배양액으로부터 단백분해효소 활성도를 관찰하였다. 또한 Chinese hamster ovary(CHO)세포를 사용하여 (51)**Cr 방출 검사법과 주사전자현미경법으로 세포독성물질을 평가(aSSam)하였고 또한 단백분해효소의 생화학적 성질을 규명한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다.

Naegleria 영양형을 마우스에 접종시킨 후 사망율을 관찰한 결과, N.fowleri를 접종시킨 마우스에서는 사망율이 75%이었으나, N.gruberi를 접종시킨 마우스에서는 사망율이 0%였다.

여러가지 단백분해효소 억제제들과 기질을 사용하여 단백분해효소의 활성을 측정한 결과, gelatin을 기질로한 전기영동과 azocasein을 기질로한 활성부위잔기 억제실험에서 N.fowleri와 N.gruberi의 단백분해효소의 억제된 활성부위 잔기와 활성도에 있어서 서로 상

이하였다.

N.fowleri의 용해물과 배양액을 이용하여 CHO세포에 대한 세포독성을 관찰한 결과, 그 용해물과 배양액 모두에서 단백질 농도의 증가에 따라 세포독성이 증가하였으나, N.gruberi의 용해물과 배양액에서는 세포독성이 거의 없었다.

N.fowleri의 용해물과 배양액의 단백분해효소는 Rf값을 서로 달리하는 효소분획으로 되어있음이 gelatin을 기질로 한 SDS-PAGE에서 관찰되었으며, Rf 0.87의 단백분해효소 분획을 용해물과 배양액에서 공통적으로 갖고 있었다. 이 N.fowleri 배양액의 부분 정제는 초

원심분리,ammonium sulfate 분별침전, Spectra/Gel AcA 44 column chromatography를 이용하여 배양액내 단백분해효소가 23.6배로 정제되었고, 회수율은 19.9%였다. Gelatin을 기질로 한 SDS-PAGE를 실시한 결과 Rf값이 0.87이었으며, 분자량을 SDS-PAGE로 측정한 결과

, 17,500 dalton이었다. N.fowleri의 배양액에서 부분정제한 분획은 여러 단백분해효소의 활성 부위잔기 억제제들자 기질을 사용하여 단백분해효소 활성이 측정되었고, 단백분해효소의 활성을 억제하였던 leupeptin, antipain, pepstatin에 의해 세포독성도 억제되었다. 이로써 cysteine과 aspartic acid 잔기가 활성에 관여함을 알 수 있었다. 부분정제한 배양액내 효소분획을 CHO세포에 처리한 후 주사전자현미경으로 관찰한 결과, 처리 30분후 표적세포의 미세융모가 점차 감소하였고 세포막에 수포와 구멍이 형성되었으며, 3시간후는 세포막의 일부가 파괴되었다. 실험성적을 종합하면 N.fowleri 배양액에서 단백분해효소의 활성이 측정되었고, 세포독성을 나타내는 단백분해효소를 부분정제 할 수 있었다.

[영문]

It has been known that Proteinases of parasites might be closely related with their pathogenicity and cytotoxicity in terms of host-parasite relationship. The present study also aimed to elucidate whether proteinases from the lysates or secrete materials of pathogenic Naegleria fowleri and Non-pathogenic N.gruberi are related With their cytotoxic activities. Mice inoculated with 1×10**5 N.fowleri trophozoites showed their cumulative mortality rate of 75% during observation, While no mouse was dead in the group inoculated with same amount of trophozoites of nonpathogenic N.gruberi. Utilizing Chinese hamster ovary(CHO) cell line incubated with radioactive (51)**Cr ( (51)**Cr -labeled CHO cells), cytotoxicities of free living amoebae were assayed. Scanning electron microscopic observations of target CHO cells affected with purified cytotoxic substance of N.fowleri were also carried out.

To determine the types and electrophoretic banding patterns of proteinases, the effect of various proteinase inhibitors on the activities were examined, and found that enzymes from N.fowleri showed different patterns from N.gruberi. Cytotoxic activities determined by the release of (51)**Cr from CHO cells were significantly detected in the lysate and cultured media of N.fowleri, but very little cytotoxic activities were shown in the lysate and cultured media of N.gruberi. Rate of flow(Rf)values electrophoretic banding patterns varied between the proteinase of

lysate and the cultured media of N.fowleri, but a value of Rf 0.87 was common in both bands. Purification of proteinase in the cultured media of N.fowleriwas performed by centrifugation, ammonium sulfate fractionation, and spectra/Gel AcA 44 column chromatography. Purification was achieved up to a 23.6 fold increase in comparison with the raw materials of the intact N.fowleri cultured media and yielded about 19.9% of the total amount.

The partially purified cytotoxic substance determined by SDS-PAGE was 17,500 dalton in molecular weight and the value of Rf 0.87 was determined by gelatin containing SDS-PAGE. Enzymatic activities in the N.fowleri cultured media were examined using various proteinase inhibitors and substrates, and confirmed that

cysteine and aspartic acid residues were responsible for the cytotoxic activity.

Scanning electron microscopic findings of the CHO cell treated with partially purified cytotoxic substance of N.fowleri for 30 up to 180 minutes showed the deterioration of microvilli on the entire surface of the cell, plasma membrane blebbing and holes in the plasma membrane.

From the above findings of the biochemical and physical properties of the cytotoxic substance from N.fowleri cultured media, it is suggested that the mainly cysteine proteinase secreted from N.fowleri might damage the cell membranes of the

target cells.