Escherichia coli에서 사람 적혈구형 포도당 운반체의 표현 및 확인

Abstract

[한글]본 연구에서는 포유 동물의 중요한 대사 연료인 포도당을 세포 내로 이동시키는 포도당 운반체의 한가지인 적혈구형 포도당 운반체(GLUT1)를 유전자 재조합 기법을 이용하여 Escherichia coli JM109(DE3)에서 표현시켰다.

적혈구형 포도당 운반체(GLUT1)의 CDNA(1.8kb)를 제한효소 NcoI으로 처리하여 얻어진 GLUT1 cDNA의 open reading frame 전체를 포함하는 1,640bp 크기의 DNA fragment를 확인하고 분리한 후 prokaryotic expression vector인 pGEMEX-1의 T7 gene 10 내에 존재하는 multiple cloning sites의 EcoRI site에 결합시켰다. 이 DNA로 E. coli JM109(DE3) 세포를 형질전환 시켜 형질전환체를 얻었다. 형질전환체로 부터 재조합 plasmid DNA(pGLUT1)를 분리한 다음 제한효소 분석으로 GLUT1의 open reading frame이 단백질로 표현되는 방향으로 삽입되었다는 것을 확인하였고, Sanger의 dideoxy-mediated chain termination 방법에 의한 DNA sequencing을 시행하여 GLUT1 cDNA가 삽입되어 있는 부위의 염기배열 순서가 제한효소 분석과 정확하게 일치하는 것을 확인하였다. pGLUT1을 포함하는 형질전환체의 염색체 DNA 내에 삽입되어 lac premoter의 조절을 받는 phage T7 RNA polymerase 유전자의 표현을 isopropylthiogalactoside(IPTG)로 유도함으로써 T7 promoter에 연결되어 있는 T7 gene 10-GLUT1 fusion gene을 표현시켰다. 세포 lysate의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) 및 GLUT1의 C-terminal peptide에 대한 항체를 이용한 western blot 분석을 시행하여 pGLUT1을 지닌 세포에서만 예상되는 분자량의 위치(MW85,000)에서 새로이 표현되는 T7 gene 10-GLUT1 fusion 단백질 band를 확인하였다.

[영문]Although the human GLUT1 was partially purified from red blood cells, the characterization of this protein has been difficult because it is very hydrophobic and glycosylated. In this study, human erythrocyte-type glucose transporter(GLUT1) was expressed in E. coli JM109(DE3) to obtain non-glycosylated form of this

protein. GLUT1 cDNA(1.8kb) was partially digested with a restriction enzyme, NcoI.

A DNA fragment(1,640bp) of GLUT1 cDNA containing the entire open reading frame of GLUT1 was subcloned into the EcoRI site of T7 gene 10 in the prokaryotic expression plasmid vector, pGEMEX-1, in order to express GLUT1 as T7 gene 10-GLUT1 fusion protein. The ligated DNA was used to transform E. coli JM109(DE3) and transformants harboring a recombinant plasmid DNA(pGLUT1) was obtained. The restriction enzyme analysis of pGLUT1 showed that GLUT1 was inserted correctly into the EcoRI site in the T7 gene 10 to be expressed as a fusion protein, and DNA sequencing of pGLUT1 confirmed the orientation and reading frame of T7 gene 10-GLUT1 hybrid gene. The expression of T7 gene 10-GLUT1 fusion protein was induced by the addition of IPTG which would induce the T7 RNA polymerase gene in host chromosome and the resulting

T7 RNA polymerase will drive the promoter located at the upstream of T7 gene 10-GLUT1 fusion gene. The Proteins within cell lysates were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and western blot analysis revealed a new protein band at MW 85,000 position, indicating the expression of T7 gene 10-GLUT1 fusion protein.