백서 간장핵에서 분리한 AP DNA Endonuclease의 특성에 관한 연구

Abstract

[한글]백서 간장핵 염색질에 존재하는 AP DNA endonucleases (APcⅠ, APcⅡ, APcⅢ)는 1M KC1 용액으로 단백질을 추출한 다음 DEAE Trisacryl column chromatography, Sephadex G-150 gel filtration과 AP DNA cellulose affinity chromatography를 시행하여 순수 정제 분리 보고된 바 있다(Lee등, 1986; Woo, 1988). 그러나 이들 효소활성에 영향을 미치는 여러가지 요소에 대한 특성 및 역학적 성질은 아직 알려져 있지 않기 때문에 본 연구에서는 백서 간장핵 염색질로부터 순수 분리한 3가지 종류의 AP DNA endonuclease가 2가 양이온, 환원제 그러고 AMP등에 의해 그 활성이 어떻게 영향을 받는 지를 밝히고 효소 역학적 분석을 통하여 AP DNA endonuclease의 활성 부위에 대한 정보를 얻고 기질에 대한 친화력 및 작용 부위등의 특성을 밝혀 각 AP DNA endonuclease의 작용 기전과 상대적 특성을 비

교하고져 본 연구에 착수하였다. 효소기질(AP DNA)은 [³H]-labeled E. coli chromosomal DNA를 산(pH 4.0)과 열(70。C, 2시간) 처리하여 제조하였으며, AP DNA의 AP 부위 수를 polyacrylamide urea gel electrophoresis를 시행하여 결정한 결과 한 개 분자(평균 69.1k

Da)당 평균 58개의 AP 부위가 생성되었고 specific activity는 3,226dpm/μg AP DNA였다.

백서 간장핵 염색질에 존재하는 3가지 종류의 AP DNA endonuclease들은 모두 sulfhydryl group 물질인 β-mercaptoethanol이나 dithiothreitol에 의해 활성이 증가되었으며, su

lfhydryl group을 가진 효소의 억제자인 N-ethylmaleimide나 HgC1^^2는 모두 AP DNA endonuclease활성도를 억제하였다. 이는 AP DNA endonuclease 활성부위에 sulfhydryl group이 있음을 간접적으로 시사한다. Mg**2+ AP DNA endonuclease활성도에 필수적인 이온이었으

며, 4mM Mg**2+ 는 효소활성도 유지에 충분한 농도였다. APcⅠ, APcⅡ, APcⅢ의 E. coli chromosomal AP DNA에 대한 Km값은 각각 0.53, 0.27, 0.36μM AP 부위였다. Adenine nucleotide중 AMP만이 AP DNA endonuclease활성도를 억제하였고 AMP에 대한 APcⅠ, APcⅡ, AP

cⅢ의 apparent Ki값은 각각 0.35, 0.54, 0.41mM이었으며, AMP에 의한 효소 억제는 모두 uncompetitive inhibition 형태였다.

APcⅠ, APcⅡ, APcⅢ에 의해 절단된 AP DNA nick에 alkaline phosphatase나 T4 polynucleotide kinase 존재 또는 부재하에 Klenow fragment를 이용하여 nick translation을 시행한 결과, alkaline phosphatase나 T4 polynucleotide kinase존재 여하에 관계없이 DNA

polymerization은 비슷하게 이루어진 사실로 미루어 AP DNA endonucleases는 AP DNA의 AP부위 좌측을 절단하여 3'-hydroxyl nucleotide와 5'-phosphomonoester nucleotide를 생성하는 것으로 사료된다.

[영문]AP DNA endonucleases(APcⅠ, APcⅡ, APcⅢ) were purified from rat liver chromatin through the extraction with 1M KC1, DEAE Trisacryl column chromatography, Sephadex G-150 gel filtration and AP DNA cellulose affinity chromatography by Lee et al.(1986). In the present study, an attempt has been made to characterize the kinetic properties and their enzyme reaction mechanisms.

Enzyme substrate(AP DNA) was prepared from [³H]-labeled E. coli chromosomal DNA by the treatment with acid(pH 4.0) and heat for 2hrs at 70。C. The number of AP site was determined by polyacrylamide urea gel electrophoresis as 58 AP sites per

molecule of AP DNA(average 69.1 kDa), and the specific activity was 3,226 dpm/μg AP DNA.

Activities of three kinds of AP DNA endonuclease were increased when sulfhydryl compounds such as β-mercaptoethanol and dithiothreitol were added to the reaction mixture, and their activities were inhibited by N-ethylmaleimide or HgC1**2, the

sulfhydryl group inhibitors, indicating that these enzymes possess sulfhydryl groups at their active sites.

Mg**2+ was essential for the activities of AP DNA endonucleases and 4 mM of Mg**2+ was sufficient for the maintenance of the optimal activities. Km values of APcⅠ, APcⅡ, APcⅢ for the E. coli chromosomal AP DNA were 0.53, 0.27, and 0.36μM AP sites, respectively. AMP inhibited AP DNA endonuclease activities among the adenine nucleotides tested, and apparent Ki values of APcⅠ, APcⅡ and APcⅢ for AMP were 0.35, 0.54, and 0.41mM, respectively. The types of inhibition were uncompetitive with respect to AMP in all cases.

The amounts of nick translations of AP DNAs nicked by APcⅠ, APcⅡ, and APcⅢ by Klenow fragment in the presence or absence of alkaline phosphatase or T4 polynucleotide kinase were similar, indicating that AP DNA endonucleases excise the AP DNA at the left side of AP site and expose 3'-hydroxyl nucleotide and

5'-phosphomonoester nucleotide.