Interleukin-6와 Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor가 배양된 제대정맥 내피세포의 혈소판활성인자 생성에 미치는 영향

Abstract

[한글]혈소판활성인자(platelet activating factor: PAF)는 강력한 염증 매개물질로서 천식, 쇼크, 전신성아나필락시, 궤양, 건선, 면역성질환 및 신장질환 등에서 중요한 역할을 담당하며 동시에 미세혈관에 면역성손상을 일으키는 중요한 작용을 한다고 알려져 있다. 또한 배양된 제대정맥내피세포에서 종양괴사인자(tumor necrosis factor: TNF)나 interleukin(IL)-1과 같은 cytokine에 의하여 PAF 합성이 증가하는 것으로 보고되어, 혈관염과 PAF의 상관관계를 잘 말해주고 있다. 소아의 급성전신성혈관염의 대표적 질환인 Kawasaki병의 경우 혈관의 손상과 더불어 혈중 IL-6의 증가가 PAF 합성을 증가시켜 혈관손상을 초래할 수 있음을 시사하고 있다.

최근 염증반응을 일으키는 중요한 cytokine으로 주목받고 있는 IL-6 및 중성백혈구의 염증반응을 배가시키는 과립 대식구 집락 촉진인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor: GM-CSF)는 TNF나 IL-1처럼 혈관내피세포를 자극하여 PAF 합성을 증가시키

고 이 증가된 PAF가 혈관의 손상을 초래하여 혈관염을 유발할 가능성이 있다.

본 연구에서는 만삭신생아의 제대정맥에서 혈관내피세포를 분리, 배양하여 IL-6와 GM-CSF가 배양된 제대정맥내피세포를 자극하여 PAF 합성을 유도하는 기능이 있는지를 조사하고자 하였다.

실험방법은 정상만삭신생아의 제대에서 정맥내피세포를 얻어 배양한 후 내피세포 동정을 위하여 형태학적 관찰과 factor Ⅷ를 염색하였다. 배양된 세포에 [(3)**H]-acetate를 유입시킨 후IL-6와 GM-CSF로 자극하고, chloroform 및 methanol로 지방성분을 추출하여 thin layer chromatography를 시행, 합성된 PAF를 beta-count하였다. 또한 PAF의 정량을 위하여 PAF [(3)**H] scintillation proximity assay system kit (Amhersham International pac, Amhersham, UK)를 이용하여 정량측정을 하였다.

실험결과는 다음과 같다.

1. 분리한 세포는 광학현미경상 전형적 혈관내피세포의 형태이며 factor Ⅷ related antigen이 강하게 염색되었다.

2. IL-6와 GM-CSF는 공히 배양된 혈관내피세포에서 PAF 합성을 자극하였으나 배양 상층액으로의 유리는 측정할 수 없었다.

3. IL-6는 자극후 30분에 최고의 PAF합성(3.0±0.4ng/we11)이 관찰되었으며, IL-6의 농도가 증가함에 따라 PAF 합성도 증가하였으나 310㎍/ml 이상에서는 더이상 증가하지 않았다.

4. GM-CSF는 자극후 2시간에 최고의 AF합성(3.2±0.3ng/well)이 관찰되었으며, GM-CSF의 농도가 증가함에 따라 PAF 합성도 증가하였으나 3nM 이상에서는 더이상 증가하지 않았다.

5. 혈관내피세포에서 IL-6와 GM-CSF의 PAF 합성 상승효과는 각각의 항체와 actinomycin D 및 cycloheximide에 의해 억제되었으며 aspirin과 dexamethasone에 의하여는 영향을 받지 않았다.

6. IL-6와 GM-CSF로 함께 자극한 경우는 각각의 단독 자극시에 비하여 PAF 합성상승효과는 관찰할 수 없었다.

이상의 결과로, IL-6와 GM-CSF는 혈관내피세포를 자극하여 PAF 합성을 증가시키며, 이와 같은 결과는 IL-6와 GM-CSF의 염증반응에 미치는 효과가 이들의 직접적 영향보다는 PAF를 통한 것으로 사료된다.

[영문]Platelet activating factor(PAF) is a potent mediator implicated in a diverse range of human diseases, including asthma, shock, systemic anaphylaxis, ulceration, psoriasis, immune and renal disorders, and a variety of inflammatory conditions.

Recently it is known that PAF plays an important role in microvascular immune injury. Tumor necrosis factor(TNF)-α and interleukin (IL)-1 also induce cultured endothelial cells(EC) to synthesize PAF. Kawasaki disese, one of the acute systemic

vasculitis in children, has been reported to have increased level of IL-6. This result denotes that increasing level of IL-6 causes production of PAF resulting in vascular damage.

Recently, IL-6 and granulocyte macrophage colony stimulating factor(GM-CSF), regarded as important cytokines in inflammatory reactions, may induce production of PAF by stimulating EC like TNF-α and IL-1. In turn the PAF may damage the vessels to have vasculitis.

In this study, the possible action of IL-6 and GM-CSF to induce the synthesis of PAF in EC was investigated.

EC from the umbilical vein were cultured and morphological observation of these cells were done with light microscope and stained for factor Ⅷ related antigen. EC incorporated with [(3)**H]-acetate were stimulated with IL-6 and GM-CSF. After

methanol extraction of cells and supernatants, the lipid material was phased into chloroform. Isolation and purification of PAF was performed by thin layer chromatography(TLC). Beta-count was then done. Platelet activating factor [(3)**H] scintillation proximity assay system kit ( Amhersham International Plc., Amhersham,

UK) was used to measure the concentrations of PAF produced from EC and cultured supernatants stimulated by IL-6 and GM-CSF.

The results are as follows;

1. IL-6 and GM-CSF stimulated cultured EC to produce PAF, but the release of PAF into supernatants were not detectable.

2. IL-6 stimulated maximum production of PAF in 30 minutes(3.0 ± 7.4 ng/well ).

As the conoentration of IL-6 increased, the production of PAF increased. But there were no increments in the concentration of 10 ng/ml and higher of IL-6.

3. G7-CSF stimulated maximum production of PAF in 2 hours (3.2±0.3 ng/well). As the concentration of GM-CSF increased, the production of PAF increased. But there were no increments in the concentration of 3 nM and higher of GM-CSF.

4. The stimulating effects of in IL-6 and GM-CSF on PAF production from the EC were inhibited by each specific antibodies, actinomycin D and cycloheximed but were net by aspirin and dexamethasone.

5. The synergistic effects of IL-6 and GM-CSF on PAF production from the EC were not observed. These results suggested that IL-6 and GM-CSF stimulate EC to increase the production of PAP.