혈중 면역복합체 검출을 위한 Raji cell ELISA법의 개발 - 임태숙 (연세대학교 보건대학원, 1990)
[한글] 혈중 면역복합체는 항원 항체로 형성되어지며 고전적 흑은 대체적 보체활성화 경로를 통하여 조직의 파괴를 초래하여 전신성 흥반성 낭창등의 자가 면역성 질환에서 병리기전으로 작용한다. 혈중에는 여러 종류의 면역복합체가 존재하며, 그 측정방법에도 여러방법이 있으나 이중 어느 방법도 한 방법만으로는 혈중 면역복합체를 정확하게 측정해 내지 못하므로 보통 두세가지 방법이 쓰이고 있다. 현재 본 면역학 검사실에서 보체성분 Clq를 이용한 고상 C,q ELISA법으로 측정하고 있는 바 혈중 면역복합체를 보다 정확히 측정하기 위하여 또 다른 방법인 Raji cell을 이용한 ELISA법을 개발하고자 하였다. 즉, Raji cell ELISA(Enzyme linked Immune-sorbent Assay)법의 단계별 요인에 따른 반응양상을 종합하여 최적조 건을 개발하고, 이 방법을 이용하여 대조군과 환자군들의 혈중 면역복합체치를 측정하여 Solid-phase(고상) C,q ELISA법, Raji cell RIA(Radioimmunoassay)법, Raji cell ELISA법간의 상관성 및 유용성을 조사하고자 본 실험에 착수하였다. 인혈청을 저이온 강도의 EDTA(ethylene diamine tetra acetic acid)용액으로 침전시켜 protein-A sepharose CL-4B column에 통과시켜 순수한 C,q를 분리하였으며, 표준곡선을 그리기 위해서는 human gamma globulin을 63℃에서 응집시킨 뒤 sephacryl S-300 chromatography column에 통과시켜 AHGG(aggregated human gamma globulin)을 자가 제조하였고, 48시간 배양된 Raji cell들을 이용하여 C,q ELISA법, Raji cell RIA법, Raji cell ELISA법등 세 가지 방법으로 자가 면역성 질환자와 정상대조군의 혈중 면역 복합체를 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. Raji cell ELISA법의 최적조건은 AHGG 와 NHS(normal human serum)희석배수 1:4, Raji cell 농도 2×10**6 cells/㎖, conjugate 희석배수1 : 1000, substrate(PNP) 반응시간 20분, 검체와 Raji cell의 반응온도를 4℃로 조절했을 때 가장 좋은 표준곡선 양상을 보였다. 2. Raji cell ELISA법의 검사간 변이계수는 13. 19%이었고, 검사내 변이계수는 5.16%로 수용 할 수 있는 범위이내 이었다. 3. 정상대조군에서 혈중 면역복합체치는 mean±SD가 solid-phase (고상) C,q ELISA법에 서 10.3±5.0 ㎍ of AHGG equivalent/me, Raji cell RIA법에서 16.3±5.0 ㎍ of AHGG equ ivalent/㎖이었고, Raji cell ELISA법에서는 11.7±5.0 ㎍ of AHGG equivalent/㎖이었다. 4. 자가면역성 환자군에서 혈중 면역복합체치는 mean±SD가 고상 C,q ELISA법에서 89.3 ±105.1 ㎍ of AHGG equivalent/㎖ Raji cell RIA법에서 118.5±140.0 ㎍ of A7GG equiva lent/㎖. Raii cell ELISA법으로는 195.5±257.5 ㎍ of AHGG equivalent/㎖로서 정상군 보다 의미 있는 높은 결과치를 보였다. 5. 고상 C,q ELISA법과 Raji cell ELISA법간의 상관계수는 0.34(P<0.0001)를 나타내었으며, 고상 C,q ELISA법과 Raji cell RIA법의 상관계수는 0.49(p<0.0001)를 보였고, Raji cell RIA법과 Raji cell ELISA법간에는 상관계수가 0.63(P(0.0001) 이었다. 이상의 결과를 종합하면 본 실험으로 Raji cell ELISA법의 최적조건을 결정할 수 있었으며, 비교적 간편하고 정확한 검사법으로 생각되었다. 또, 혈중 면역복합체의 보다 정확한 측정을 위해서는 측정방법의 원리와 민감도등을 고려하여 고상 C,q ELISA법과 함께 Ra ji cell ELISA법을 조합하여 사용하는 경우 임상적 활용도가 높을 것으로 사료되었다. [영문] There are various kinds of circulating immune complexes (cic)and we have a number of methods of measuring them. However, any of them can not alone measure cic correctly, usually two or three methods are combined to be applied. Currently, in the immunological laboratory, the solid-phase Clq ELISA (Enzyme Linked Immune-sorbent Assay) which uses a component of the complement system(C,q) is commonly used, but in an effort to more correctly measure cic, another kind of ELISA using Raji cell was experimented. To be more specific, optimum conditions were put forward synthesizing the reaction factors of the Raji cell ELISA, and based on those conditions, cics of the autoimmune disease patients and the normal control group were measured with the three methods(Raji cell ELISA, Raji cell RIA and Clq ELISA). Following results were obtained, 1. The optimum conditions of the Raji cell ELISA which displayed the best standard curve were; 1:4 dilution ratio of AHGG;1 : 4 dilution ratio of NHS, 2×10**6 cells/me of Raji cell numbers, 1:1,000 dilution ratio of conjugate, 20minutes of substrate(PNP) reaction time and 4℃ reaction temperature of sample and Raji cells. 2. The coefficient(C. V.) variation of interassays of the Raji cell ELISA was 13.19%, which that of intraassay was 5.16%. 3. For the normal control group, the mean of cia levels was 10.3±5.0 (mean±S.D) ㎍ of AHGG equivalent/㎖ with the Raji cell RIA, and 11.7±5.0 ㎍ of AHGG equivalent/㎖ respectively. 4. For the autoimmune disease patient group, the mean of cic levels was 89.3±105.1 (mean±S.D.) ㎍ of AHGG equivalent/㎖ with the solid-phase Clq ELISA, 118.5±140.0 ㎍ of AHGG equivalent/㎖ with the Raji cell RIA and 195.5±257.5 ㎍ of AHGG equivalent/㎖ with the RaJi cell ELISA, all of which showed higher levels of cics than the normal control group significantly. 5. It was also revealed that correlation between the solid-phase Clq ELISA and Raji cell ELISA was 0.34(P<0.0001), while the correlation between the solid-phase Clq ELISA and the Raji cell RIA and between the Raji cell RIA and the Raji cell ELISA were 0.49(P<0.0001) and 0.63(P<0.0001) respectively. Summing up. the optimum condition of Raji cell ELISA is established, and in order to more correctly measure the sic levels, the principle of measurement and the sensitivity of the tests should be considered. In this regard, the combined use of the solid-phase Clq ELISA and the newly-experimented Raji cell ELISA is believed to be more effective than single Clq ELISA.
보건학과/석사