Pathogenetic target identification for Thyroid-Associated Orbitopathy through High Throughput RNA sequencing

Abstract

Background: Thyroid-Associated Orbitopathy (TAO) is an autoimmune disorder which is a potentially sight-threatening ocular disease. Because of complexity and autoimmune features of TAO, its pathogenesis remains to be elucidated. The objective of this study was to explore potential biomarkers through high throughput RNA sequencing method. Method: We applied RNA-sequencing (RNA-seq) to orbital tissue from five TAO subjects who performed orbital decompression surgery for the treatment of TAO and five non-TAO orbital tissues obtained from subjects having other orbital surgery. RT-PCR was performed to validate the gene expression level, we used the orbital tissues obtained from five other TAO patients and four non-TAO controls. Results: We identified 184 consistently differentially expressed genes comprising 120 upregulated and 64 down-regulated genes. From those genes, top 10 up-regulated genes and 14 up-regulated genes which were enriched in three pathways, TGF-beta, TNF, and WNT pathways, found by KEGG analysis, were selected. Finally, 24 up-regulated hub genes were used for further validation. Among them, SOCS3 and NR4A1 were revealed as higher expression genes in TAO orbital tissue compared to non-TAO orbital tissue. SOCS3 gene showed greater expression levels in orbital tissues from TAO patients than non-TAO subjects. Conclusions: In this study, we revealed genes associated with TAO pathophysiology using high-throughput RNA-seq technology that most of up-regulated genes showed their roles in the regulation of cell transcription and immune processes. Furthermore, genes which found altered levels of expression in TAO subjects might have important role in the disease phenotype and might be the therapeutic target. 배경: 갑상선 안구병증은 갑상선 기능항진증의 가장 많은 원인인 그레이브스병과 함께 발생할 수 있는 안구의 질환으로, 안구통증, 복시, 시야장애 등의 다양한 질환의 경과를 가질 수 있다. 갑상선 안구병증은 자가면역질환의 하나로, 아직까지 질환의 병태생리가 명확히 밝혀져 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 갑상선 안구병증의 진단 또는 치료의 유전적인 바이오마커를 확인하고자 high throughput RNA 시퀀싱을 이용하여 분석 하였다. 방법: 갑상선 안구병증을 진단받고 안와 감압술(orbital decompression surgery)를 시행받은 환자 5명의 안구 조직과 다른 안과적 질환으로 안와 수술을 받는 대조군 5명의 안구 조직을 이용하였다. 확인된 유전자들의 유전자 발현의 정도를 검증하기 위해 RT-PCR 방법을 사용하였다. 결과: 총 184개의 유전자를 확인하였고, 그 중 120개의 상향 조절 유전자(up-regulated gene)와 64개의 하향 조절 유전자(down-regulated gene)을 확인하였다. 184개의 유전자 발현과 연관된 경로를 확인할 수 있는 KEGG 분석을 이용하여 TGF-베타 경로, TNF 경로, WNT 경로가 연관성 있는 경로였고, 이 경로와 연관된 14개의 상향 조절 유전자와 전체 184개 중 상위 10개 상향 조절 유전자를 선택하여 추가 분석을 시행하였다. 24개의 중추 유전자(hub gene)들을 RT-PCR로 검증하였을 때, SOCS3와 NR4A1이 대조군 대비하여 갑상선 안구병증 환자들의 안구 조직에서의 발현이 높았다. SOCS3의 경우 갑상선 안구병증에서의 유전자 발현이 상향되어 있음을 추가적으로 확인할 수 있었다. 결론: 갑상선 안구병증의 병태생리에 관여할 수 있는 여러 가지 유전자들의 발현을 RNA-시퀀싱 방법을 통해서 확인할 수 있었고, 대부분이 세포의 전사과정이나 면역반응에 관여하는 유전자임을 알 수 있었다. 추후 추가적인 실험과 분석을 통하여 갑상선 안구병증의 질환의 특성, 진단적 마커 또는 치료 타겟이 될 수 있는 마커 유전자를 확인할 수 있는 연구가 필요할 수 있겠다.