소 신장 transamidinase의 분리 정제 및 그 성질에 대한 연구

Abstract

[영문]

[한글]

Creatine은 척추동물에서 에너지대사에 매우 중요한 역할을 하고 있다. 즉 근육이나 신

경조직, 그외에 에너지소모가 많은 조직에서 creatine은 creatine ptoaphate로 저장되어

있다가 ATP소모가 ATP생산을 능가할 때 ATP를 빠르게 공급하여 조직내 ATP함량을 유지시

킨다.

Creating은 aminine의 amidine기가 glycine의 amino기에 전달되어 guanidoacetic acid

를 형성하며 이 반응은 L-arginine; glycine transamidinase(EC 2. 1. 4. 1)에 의해 촉매

되고 methyltransferase(EC 2. 1. 1. 2)에 의하여 creatine이 합성된다(Borsook과 Dubnof

f, 1940, 1941).

Transarnidinase는 그 조직내 황성의 분포가 species에 따라 매우 다르고 그 성질이나

반응성질도 species에 따라 차이가 있는 것으로 보고되었다(McGuire등, 1980).

이에 본인은 백서와 소의 자 장기내 transamidinase찰성분포를 비교하고 소의 신장에서

transamidinase를 분리 정제하여 그 분자량자 Km치, 반응성질을 규명하여 기왕에 분리정

제되었던 쥐와 돼지의 신장 transamidinase와 비교 관찰하여 다음과 같은 성적을 얻었다.

1. 소와 쥐의 각 장기내 tranaamidinase황성의 분포 ; 쥐의 신장(13.12±3.12unit/g we

ttissue)과 췌장(5.37±0.73 unit/g wet tissue)은 높은 transamidinaae의 활성을 가지나

고환, 뇌조직과 spleen은 활성이 각각 0.72±7.05 unit/g wet tissue, 0.42±0.04 unit/

g wet tissue, 그리고 0.25±0.12 unit/g wet tissue로 효소활성이 낮았다. 특히 쥐의 간

장조직은 0.08 unit/g wet tissue로 매우 낮은 transamidinase의 활성을 가지는 것으로

나타났다.

이에 비하여 소의 간장조직은 매우 높은 transamidinase활성을 가지며(13.24±3.12 uni

t/g wet tissue), 췌장(11.47±0.63 unit/g wet tissue)과 신장 (5.12±0.37 unit/g wet

tissue)도 활성이 높은 것으로 나타났다. 소의 고환, 뇌조직과 spleen은 각각 0.55±0.26

unit/g wet tissue, 0.33±0.15 unit/g wet tissue, 0.44±0.27 unit/g wet tissue로 효

소활성이 낮았다. 이러한 결과로 미루어보아 transamidinase의 각 장기내 활성분포는 소

와 쥐에사 서로 다른 것을 알 수있으며 특히 간장조직에서 그 차이가 큰 것을 알 수 있다

.

2. 소 신장 transamidinase의 분리 정제 ; 소 신장 transamidinase는 황산 암모늄 처리

, Sephadex G-150 gel filtration, 그리고 두번의 DEAE-Sephadex A-50 이온교환 chromato

graphy를 통하여 88배 분리정제되었다. 분리정제된 소 신장 transamidinase의 specific a

ctivity는 3.7μ moles ornithine/hr/mg protein이었고 이때 효소활성은 8.6% recover되

었다. 88배분리 정제된 소 신장 transamidinase는 disc-gel 전기영동에서 단일 단백질로

나타난 사실로 미루어 이 효소가 순수분리되었음을 시사하는 결과로 사료된다.

3. 소 신장 transamidinase의 분자량 ; 소 신장 transamidinase는 SDS-polyacrylamide(

7.6%) 전기영동에시 단일 단백질 band로 나타났으며 분자량은 44,000으로 계산되었고 Sep

hadex G-150 gel filtration을 통하여는 그 분자량이 90,000으로 계산되었다. 이 결과는

소 신장 transamidinaae는 두개의 같은 subunit로 구성되어 있음을 시사한다.

4. Km치와 kinetic study; (1) glycine농도를 25mM로 고정하고 arginine농도를 변화시

키면시 double reciprocal plot을한 곁과 arginine에 대한 Km치는 1.4mM이었으며 다시 ar

ginine농도를 20mM로 고정하고 glycine농도를 변화시키면서 double reciprocal plot을 한

결과 glycine에 대한 Km치는 2.77mM이었다. (2) glycine농도를 각각 5mM, 10mM, 25mM로

고정하고 arginine의 농도를 0.686mM에서 6.86nM까지 변화시키면서 double reciprocal pl

ot을 한 결과 서로평행선을 나타낸 사실로 보아 이 효소는 double displacement(Ping-Pon

g BiBi)반응기전에 의한 촉매작용을 하는 효소로 사료된다.

A Study on Bovine Kidney Transamidinase ; Purification and its Properties

Young Sook Im

Department of Medicai Science The Graduate School, Yonsei University

(Directed by prof. Yoon Soo Kim, M.D., Ph.D.)

Creatine bas a major role in vertebrate energy metabolism. Phosphocreatine is

uses to maintain ATP levels in muscle and other tissues whenever ATP utilization

exceeds its production from metabolic fuels.

The first reaction in the biosynthesis of creatine is tIne transfer of the

amidine group of arginine to the amino group of glycine to form guanidoacetic

acid(Borsook and Dubnoff, 1941). This reaction is catalyzed by the enzyme

L-arginine; glycine transamidinaae(EC 2. 1. 4. 1). The organic distribution of

transamidinaae activity has been gained attention due to its species-specific

organic distribution. McGuire et at(1980) reported that the properties and activity

distributions of transamidinase from different species are not identical. This

study was undertaken to inveatigate the physical and kinetic properties of purified

tranaamidinase from the cow kidney and compared the properties of kidney

transamidinaae with those from rat and hog. The results are summariged ae follows :

1. The distribution of transamidinase activities in rat and cow organs;

Kidney(13.12±3.12 units/g wet tissue) and pancreas(5.37±0.73 units/g wet tissue)

of male rats contain high transamidinaae activitiea. Testes(0.72±0.05 units/g wet

tissue), brain(0.42±0.04 units/g wet tissue) and spleen(0.25±0.12 units/g wet

tissue) have low transamidinase activities. Rat liver contains very low

transamidinaae activity(0.08 units/g wet tissue). Whereas bovine liver(13.24±3.12

units/g wet tissue), pancreas(11.47±0.63 units/g wet tissue), and

kidney(5.12±0.37 units/g wet tissue) have very high enzyme activities, the

transamidinase activities in testes(0.55±0.26 unit/g wet tissue),

spleen(0.44±0.27 unit/g wet tisane) and brain(0.33±0.15 uuit/g wet tissue) of cow

were very low. These results indicate that organic distribution of transamidinase

activities are different from species(cow and rat). especially in liver.

2. Purification of bovine kidney transamidinase : Bovine kidney transamidinase

was purified 88 folds through the procedures of ammonium sulfate treatment,

Sephadex G-150 gel filtration, first and second DEAE-Sephadex A-50 ion-exchange

chromatography. The specific activity of enzyme from second DEAE-Sephadex A-50

ion-exchange chromatography was 3.7μmoles of ornithine/hr/mg protein and purified

88 folds and recovery of enzyme activity was 8.6%. This enzyme migrated as a single

protein band in polyacrylamide gel electrophoresis, suggesting that transamidinase

thus isolated is highly pure.

3. Molecular weight determination : The molecular weight of bovine kidney

transamidinase was calculated to be 90,000 by Sephadex G-150 gel filtration

chromatography. This enzyme migrated aa a single protein band in

SDS-polyacrylamide(7.6%) gel electrophoresis and molecular weight was calculated to

be 44,000. These results indicate that bovine kidney transamidinase consists of two

identical subunits.

4. Km values and kinetic studies: The Km values for arginine and glycine were 1.4

mM and 2.77 mM respectively. The double reciprocal plots of transamidinase activity

in 5, 10, and 25 mM constant glycine concentrations with various concentrations of

arginine(0.686 mM-6.86 mM) showed parallel lines. These patterns indicate that this

enzyme catalyzes double displacement(Ping-Pong BiBi) reaction.