하인두 편평세포암의 침습과 전이에 간세포성장인자와 그 수용체인 c-Met의 역할

Abstract

[한글](연구배경) 간세포성장인자(Hepatocyte Growth Factor, 이하 HGF)는 간세포 뿐아니라 체내 다양한 세포와 종양에서 증식, 분산, 이동 및 침습에 관여하며 종양주위의 신생혈관을 생성하는 것으로 알려져 이에 관한 많은 연구가 진행되고 있다. 본 연구는 두경부 종양 중 주변조직으로의 침습과 전이를 잘 하는 하인두암에서 HGF와 c-Met의 발현에 따른 임상적인 의의를 알아보고 HGF가 하인두암의 증식, 이동과 침습에 있어 어떠한 역할을 하는지를 알아보고자 하였다.

(대상 및 방법) 하인두암으로 수술받은 40예의 시료를 이용하여 HGF와 c-Met의 면역조직화학적 염색을 시행하였고 5예의 하인두 정상과 암조직을 이용하여 RT-PCR과 Western blotting을 시행하였다. 하인두암 세포주인 FaDu(ATCC)을 이용하여 RT-PCR과 Western blotting을 시행하였다. HGF의 농도(10, 30ng/ml)에 따른 종양세포의 증식, 분산을 측정하고 wound healing assay와 Transwell chamber를 이용한 종양세포의 이동과 침습을 분석하였다. 또한 FaDu에서 MMP-2와 9의 발현과 활성도를 보기위해 RT-PCR과 Zymogram를 시행하였고 하인두암에서 분비되는 HGF 분비유도물질의 존재여부를 확인하기 위해 사람의 섬유아세포(MRC-5)를 이용하였다./(결과) 면역조직화학적 염색상 HGF는 77.5%, c-Met는 70%에서 양성을 보였고 HGF는 림프절 전이와 종양의 임상적 병기의 증가에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보였다. c-Met의 경우 임상적 병기의 증가에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 하인두암 조직의 RT-PCR 결과 HGF와 c-Met의 발현이 정상 조직에 비해 암조직에서 유의하게 증가되었으며 FaDu에서는 HGF의 발현은 없었고 c-Met의 발현만 확인되었다. Western blotting에서는 1예를 제외하고 4예에서 정상에서는 c-Met의 발현이 거의 없었으나 하인두암에서는 c-Met의 발현이 강하게 나타났으며 FaDu에서도 c-Met의 발현이 강하게 나타났다. 하인두암 세포주의 증식, 분산, 이동과 침윤검사에서 HGF를 처리한 경우가 대조군에 비해 증식, 분산, 이동과 침윤이 유의하게 증가하였고 이는 HGF의 농도에 비례하였다. MMP-2, 9의 RT-PCR에서 MMP-2, 9의 발현이 확인되었고 30ng/ml의 HGF로 처리한 경우에 MMP-2의 발현이 증가되었다. Zymogram상 FaDu에서는 MMP의 활성도가 나타나지 않았으나 FaDu의 배양액에서는 MMP-2의 발현이 강하게 나타났는데 HGF를 처리한 경우에 활성도가 증가되었다. FaDu의 배양액을 MRC-5에 넣어준 경우와 넣지 않은 경우에 HGF의 분비를 ELISA검사를 통해 확인한 결과 FaDu의 배양액을 넣은 경우 통계적으로 유의하게 HGF의 분비가 증가된 것을 확인할 수 있었다.

(결론) HGF와 c-Met의 발현이 하인두암의 림프절 전이와 진행에 관련이 있으며 HGF가 하인두암의 증식, 분산, 이동과 침습을 증가시키는 것으로 확인되었고 하인두암의 침습에 있어 MMP-2가 역할을 하고 이에 HGF가 일부 영향을 주는 것으로 나타났으며 하인두암에서 분비되는 HGF 분비유도물질에 의해 섬유아세포에서의 HGF 분비가 유의하게 증가됨을 알 수 있었다.

[영문]Hepatocyte growth factor (HGF), a potent stimulator of hepatocyte growth, stimulates motility, invasiveness, proliferation, and morphogenesis of epithelium, and it may be involved in physiologic and pathologic processes such as embryogenesis, wound healing, organ regeneration, inflammation, and tumor invasion. So we examined the role of the HGF/c-Met on invasion and metastasis of hypopharyngeal squamous cell carcinoma(SCC).

We performed immunohistochemical stains on 40 normal mucosas and 40 SCCs of hypopharynx with HGF antibody and c-Met antibody. For RT-PCR and Western blot, fresh normal tissues and cancer tissues in hypopharynx obtained from five patients and hypopharyngeal cell line(FaDu) were used. To find proliferating effect of HGF, the number of viable cells was estimated by the proliferation assay according to the concentration of HGF(0, 10, 30 ng/ml). Tumor cell migration and invasiveness were assessed by wound healing assay and the membrane invasion assay(using Transwell chamber). To examine the role of the matrix metalloproteinases(MMP) and the relation between HGF and MMP in invasion of hypopharyngeal cancer, RT-PCR and zymography were performed in FaDu cells. And we examined enhancement of HGF production in human fibroblast(MRC-5) by putative inducer secreted from FaDu cells.

The positive rates of HGF and c-Met expression in hypopharyngeal SCC were 77.5% and 70%, respectively. HGF staining was significantly correlated with lymph node metastasis and pathologic stage (p<0.05). c-Met staining was only significantly correlated with lymph node metastasis (p<0.05). The increased expresssion of c-Met mRNA(RT-PCR) and protein (Western Blot) were detected in hypopharyngeal cancer tissue and cancer cell line. Exogenous HGF significantly enhanced the growth of FaDu in a dose-dependent manner (p<0.05). HGF stimulated dispersion and markedly enhanced the migration and invasion of cancer cells in a Transwell invasion chamber in a dose-dependent manner(p<0.05). The expression of MMP was detected in hypopharyngeal cancer cells and exogenous HGF slightly enhanced the induction of MMP-2 activity in zymogram analysis. HGF produced by stromal fibroblast(MRC-5) was increased through certain inducer originated from FaDu cells (p<0.05)./These results suggest that HGF may plays an important role in progression of hypopharyngeal cancer through the enhancement of proliferation, migration and invasion.