에스트로겐 수용체 활성화에 HER-2/neu 발현과 ERβ 스플라이싱 변형체(splicing variants)의 역할

Abstract

[한글]

현재까지 유방암의 발암기전은 명확하게 규명되어 있지 않으나 에스트로겐 수용체 (ERs)와 성장인자 수용체 (growth factor receptor)의 역할이 중요하다고 알려져 있다. 에스트로겐 (E2)은 에스트로겐 수용체 (ERs)에 결합하여 전사조절에 관여하고, 성장인자 수용체에도 영향을 미쳐 세포의 성장 뿐 아니라 다양한 생물학적 작용을 나타낸다. 따라서, 에스트로겐의 세포 내 농도를 감소시키거나 그 효과를 억제하려는 많은 약제들이 개발되어 사용 되었지만, 다양한 약제를 시도해 왔음에도 불구하고 아직도 유방암 치료율은 그다지 높지 않다. 이는 에스트로겐 요법에 대한 내성뿐 아니라 항에스트로겐 제제에 의해 차단되지 않는 다른 종류의 성장인자들이 종양증식에 관여한다는 점을 간접적으로 시사한다.

본 연구에서는 에스트로겐 수용체 활성화에 유방암의 발생과 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀진 대표적 성장인자의 하나인 HER-2/neu의 과발현이 에스트로겐 및 tamoxifen에 의한 ERE, AP1 매개활성 변화에 미치는 영향을 분석하고자 reporter constructs를 사용하여 측정하였다. 또한, 최근 발암과정에서 중요한 기능을 할 것으로 기대되는 ERβ 스플라이싱 변형체의 세포 내 역할을 조사하기 위해 MCF-7 ERα 양성 유방암 세포주에 ERβ 스플라이싱 변형체인 ERβ2/cx를 transient transfection하여 ERα 전사 활성에 미치는 영향을 평가하였고, 에스트로겐 수용체를 통한 전사활성에 직접적으로 영향을 미치는 coactivator (SRC-1, P/CAF, CBP, AIB1)와 corepressor (SMRT, N-coR)의 발현 변화를 multiple-PCR 방법을 이용하여 확인하였다. 그리고 MCF-7 ERα 양성 유방암 세포에 에스트로겐 및 tamoxifen 처리에 따른 Ki-67, c-myc, p27, NF-kB, phospho-ERK 등과 같은 세포 내 단백질의 변화를 Western blot으로 확인하였다.

본 연구 결과, 에스트로겐이나 tamoxifen에 의한 반응은 에스트로겐 수용체를 매개로 나타났으며, ERs와 단백질 상호작용으로 전사활성을 나타나는 AP1 복합체와의 반응은 큰 변화를 보이지 않았지만 MCF-7 유방암 세포에서 HER-2 과발현으로 인한 리간드 독립적인 활성변화가 나타났다. 또한, 고농도의 ERβ2/cx 변형체의 발현이 ERα 활성을 억제 하였고, cofactor는 시간에 따라 미약한 발현변화의 양상을 보였다. 또한, 에스트로겐이나 tamoxifen 처리에 따른 세포 내 단백질의 변화는 c-myc, Ki-67의 증가와 NF-kB, phospho-ERK의 핵으로 이동이 증가했고, p27Kip1 과 같은 세포주기 억제 단백질이 감소되는 결과를 보여주었다.

결론적으로 HER-2의 과발현은 MCF-7 세포에서 리간드 독립적으로 AP1 매개 전사활성을 증가 시킬 수 있고, ERβ2/cx 스플라이싱 변형체의 발현은 ERα의 전사활성을 억제 할 수 있는 가능성을 보였다.

[영문]Carcinogenesis of breast cancer has not been fully understood until recently, but it is known that the roles of estrogen receptor (ERs) and growth factor receptors are important. Estrogen works as a transcriptional unit after combining to estrogen receptor (ERs), and demonstrates various biologic effects including cellular growth through its influence a growth factor receptors. Endocrine therapy to reduce intracellular concentration of estrogen or to suppress the estrogen action using various drugs had been developed. However, in spite of various efforts, the cure rate of breast cancer is seldom high yet. The low cure rate by antiestrogen therapy suggests that other kind of growth factors that is not blocked by antiestrogen as well as resistance to estrogen treatment are involved in tumor propagation indirectly.

In this study, we measured the effect of HER-2 over-expression, one of representative growth factors that has been proven to be involved in the activation of estrogen receptor and tumorigenesis of breast cancer, in change of ERE and AP1-mediated transcriptional activity by estrogen and tamoxifen using reporter constructs. Also, to investigate the roles of ER β splicing variant that may have a important role in the carcinogenesis process as reported recently, ERα transcriptional activity was mesured after transient transfection of ERβ splicing variant to MCF-7. Changes in the expression of coactivator (SRC-1, P/CAF, CBP, AIB1) and corepressor (SMRT, N-coR) that is involved directly in the transcriptional activity of ERα was analyzed using multiple-PCR method. In addition, we investigated the changes of intracellular proteins, such as Ki-67, c-myc, p27kip1, NF-kB, phospho-ERK using western blot when MCF-7 cell lines were treated with estrogen and tamoxifen.

The results showed that estrogen receptor mediated estrogen and tamoxifen''s transcriptional activity. Although transcriptional activity by interaction with AP1 complex did not show dramatic changes, ligand independent transcriptional activity took place in MCF-7 breast cancer cell by HER-2 overexpression. ERβ2

cx splicing variant of high concentration suppressed ERα''s transcriptional activity and it induced time-dependent minor changes of cofactor''s expression. Estrogen and tamoxifen treatment on MCF-7 cell line induced increased intracellular concentration of c-myc, Ki-67 and nuclear translocation of NF-kB and phospho-ERK and decreased intracellular cell cycle suppresser protein such as p27kip1.

In conclusion, the above listed results suggest that expression of ERβ2

cx splicing variant suppresses ERα transcriptional activity, and over-expressed HER-2 can increase ligand-independent AP1-mediated transcriptional activity in MCF-7 cells.