실험적 Legg-Calve>-Perthes씨 병 동물모델에서 대퇴골두내 혈관내피 성장인자의 발현

Abstract

[한글]Legg-Calvé-Perthes씨 병은 소아 대퇴골두의 골화중심에 무혈성 괴사가 발생하는 질환으로, 괴사 후 골두의 재생 과정에서 관절내 유치(containment)가 적절치 못한 경우 결국 골두의 변형, 성장 장애를 일으키는 자기 한정성(self-limiting) 질환이다. 지금까지의 연구로는 골단에서 일어나는 무혈성 괴사에만 초점을 두었으나, 실제로는 골성장판의 이상도 같이 동반하고 있으며, 골성장판에서 일어나는 병적 변화에 대한 연구는 없었다. 본 연구에서는 괴사의 가역성의 문제와 골단 및 골성장판의 이상을 충족시키는 동물모델로 Wister kyoto rats(WKY)에서 선천적으로 고혈압이 있는 쥐를 근친교배한 자발성 고혈압 흰쥐를 이용하였다.

골성장판의 분화 및 연골내 골화에 있어서 혈관유입은 필수적인 요소라고 보고 되고 있다. 혈관유입에 관여하는 여러 가지 성장 인자들 중 혈관내피 성장인자로 조절되는 신생혈관 유입은 연골내 골화 과정에서 필수적이다.

본 연구에서는 정상 대조군인 WKY와 실험군인 SHR에서 연골세포의 고사와 골성장판, 골단, 그리고 관절연골에서 혈관내피 성장인자의 발현을 비교하여, 대퇴골두의 성장 이상과 연골세포의 고사, 혈류 공급 이상과의 상관관계를 규명하고자 하였다.

각각 6, 9, 12, 15, 18주령의 SHR 12마리씩 총 60마리를 실험군으로, 동일 주령의 WKY 각각 6마리씩 총 30마리를 대조군으로 하였다. 양쪽 대퇴골두를 적출하고 광학현미경 하에서 관찰하여 조직학적 검사 상, 자발성 고혈압 흰쥐의 골단에서 성장장애 및 괴사 소견이 관찰된 경우를 SHR+n군, 정상적인 골화과정을 보였던 경우를 SHR-n군, 대조군 WKY군 등 세 그룹으로 나누었다. 세포고사도를 알기 위하여 TUNEL assay를 수행하여 전체 골성장판 및 부위별로 양성인 세포의 백분율을 내었다. 혈관내피 성장인자(VEGF) 면역화학조직염색법을 시행하여, 골성장판, 골단 및 관절연골에서 혈관내피 성장인자의 발현정도를 비교하였고, 특히 골성장판에서의 양성인 세포의 비율을각 군별로, 주수별로 측정하였다. 통계는 two-way ANOVA로 처리하였다.

골성장판 내 세포고사의 관찰에서 모든 SHR군은 대조군인 WKY군보다 높은 세포고사율을 보였다. 혈관내피 성장인자는 대퇴골두의 관절연골 및 골단, 그리고 골성장판 모두에서 발현이 되었으며 정상적인 골화과정을 거치면서 점차 감소하는 양상을 보였다. 골성장판 및 골단에서의 혈관내피 성장인자의 발현은 WKY군 보다 SHR군에서 감소되어 있었으며 SHR+n군에서 SHR-n군보다 더욱 감소되었다. 관절연골에서는 세군 모두에서 정상적으로 발현이 되었다. 이차골화중심에서는 혈관 내피 성장인자가 발현이 된 주변으로만 골화가 진행되었다. 이상으로 혈관내피 성장인자의 발현은 성장이 진행되면서 감소하는 성장단계에 의존적이며 또한 괴사가 발생한 골화중심 및 골성장판에서는 감소하나 관절연골에는 정상적으로 발현되는 조직 특이성을 띄며, 혈관내피 성장인자의 발현이 되어야 정상 골화가 가능한 점으로 혈관내피 성장인자는 골성장판 및 골화중심의 정상 골화 과정에 있어서 필수적인 요소로 사료된다.

[영문]Legg-Calvé-Perthes disease is a self limiting-disease, characterized by ischemic necrosis of the secondary ossification center in the femoral head. In the process of regeneration of necrotic femoral head, improper articular containment induces femoral head deformity and growth disturbance such as coxa magna, coxa brevis, and trochanteric overgrowth. Although metaphyseal growth plate is known to be affected by the disease process, the pathologic changes within the growth plate remain unknown. An animal model, using Spontaneously Hypertensive Rats(SHRs) is introduced to investigate both reversibility of necrosis and involvement of growth plate.

Angiogenesis is required for differentiation of growth plate and endochondral ossification. Angiogenesis induces chondrocyte apoptosis, and recruits several cells and essential factors for bone morphogenesis. A number of growth factors have been reported, among which, the vascular endothelial growth factor(VEGF) induces blood vessel invasion which is essential for endochondral ossification.

In this study, apoptosis and VEGF expression in the experimental SHR were compared with control Wister Kyoto rats(WKY). The correlation in growth disturbance of femoral head, chondrocyte apoptosis, and improper angiogenesis is intended to reveal.

60 SHR and 30 WKY were sacrificed at 6, 9, 12, 15 and 18 weeks of age. Experimental SHR groups were divided into SHR-n and SHR+n according to the histopathological changes in the ischemic necrosis of secondary ossification center in femoral head. WKY groups were used as control. TUNEL (transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling) assay was done for the investigation of apoptotic changes in the growth plate. VEGF immunohistochemistry was used to identify of expression of VEGF in growth plate, epiphysis and articular cartilage. Results were analyzed by two-way ANOVA.

Apoptosis of growth plate in SHR groups was higher than that of WKY groups. VEGF was expressed in articular cartilage, epiphysis and growth plate of all three groups, which decreased in the course of normal ossification. VEGF expression in epiphysis and growth plate was decreased in the group of SHR. The expression was lowest in the group of SHR+n when compared with other groups. Normal expression was found in articular cartilage of all three groups. Ossification was found around VEGF expressed areas.

In conclusion, VEGF expression was time-dependent with increasing aging and tissue specific which was not found in articular cartilage. VEGF was thought to be an essential factor for the longitudinal growth of growth plate and normal ossification.