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Fgf9 repression of Msx2 gene expression enhances transcriptional activity of osteocalcin gene

Title
Fgf9 repression of Msx2 gene expression enhances transcriptional activity of osteocalcin gene
Other Titles
조골세포 분화기전에서 Fibroblast Growth factor 9 (FGF9)의 Msx2발현 억제에 의한 osteocalcin gene 의 전사
Issue Date
2004
Publisher
Graduate School, Yonsei University
Description
Dept. of Dental Science/박사
Abstract
[한글] 섬유아세포 성장인자 수용체2 (FGFR2) 혹은 엠에스엑스 2 (MSX2) 유전자의 돌연변이는 각 단백질의 기능항진을 통해 두개골 유합증을 유발한다. 두 가지 유전자 모두 두개관의 골형성에 매우 중요하며 발육중인 두개봉합의 초기 조골세포에서 발현하는 것으로 알려져 있으나 이 두 요소의 조절기전에 대해서는 알려진 바가 미미하다. 따라서 본 연구에서 FGF/FGFR 신호전달계가 MSX2 유전자 발현의 상부 조절자인지 여부를 알아보고 분화중인 조골세포에서의 이들 유전자의 가능한 조절기능을 알아보고자 하였다. 세포 수준에서 일어나는 분자생물학적 반응을 조사하기 위해 쥐 두개관에서 얻은 일차 조골세포를 배양하였다. 각각 다른 성숙 단계에 있는 조골세포에서 Fgfr2와 Msx2 의 표현 양상을 관찰한 결과 Msx2의 고도의 발현이 Fgfr2보다 앞서 나타나는 것으로 나타났다. Msx2 유전자의 발현에 대한 Fgf/Fgfr 신호전달계의 영향을 알아보기 위해 일차 조골세포를 Fgf9으로 처리한 결과 Msx2 유전자의 발현이 어떤 단백질 합성 경로를 통해 유의한 수준으로 감소하는 것을 발견하였다. 이러한 하향 조절의 의미를 알아보기 위해 헴어글루티닌 (hemagglutinin) 표식자가 부착된 Msx2유전자를 함유한 아데노바이러스 (adenovirus) 를 이용하여 Msx2유전자를 과발현시켰다. 역전사효소-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 결과 과발현된 Msx2 하에서 내인성 오스테오칼신 (osteocalcin) 유전자가 Fgf9 처리후에도 억제됨을 관찰하였다. 또한 젤 전이실험 (gel-shift assay) 을 통해 Msx2의 과발현된 경우 Fgf9하에서도 코어결합인자알파1 (Cbfa1/Runx2) 의 OSE2서열과의 결합이 저하됨을 발견하였다. Msx2의 과발현 후 6XOSE2 – 루시퍼라아제 (luciferase) 유전자를 주입한 경우 역시 Fgf9 처리시에도 전사활성이 떨어짐을 확인하였다. 이상의 결과에 따라 본 연구에서 Fgf/Fgfr이 Msx2의 억제자로 작용함으로써 Cbfa1/Runx2의 기능을 변환시켜 궁극적으로 조골세포의 분화를 촉진하는 조골세포 분화모델을 제시하였다.
[영문]Mutations of either FGFR2 or MSX2 genes cause craniosynostosis via similar gain-of-function mechanism. Both genes are known to play crucial roles in the calvarial bone formation and are expressed in the early osteoblast stage in the developing cranial suture. However, the regulatory function between FGF/FGFR and MSX2 is not known. Thus, we asked if Fgf/Fgfr signaling is an upstream regulator of Msx2 gene expression in the same genetic pathway and wished to elucidate the possible regulatory role of these genes in differentiating osteoblasts. To investigate further the molecular events occurring in the cell level, we used an in vitro culture with primary mouse calvarial osteoblasts. We demonstrated the expression pattern of murine Fgfr2 and Msx2 gene in different maturation stage, with peak expression of Msx2 gene preceding that of Fgfr2. To examine the effect of Fgf/Fgfr signaling on the Msx2 gene expression, primary osteoblasts were treated with Fgf9, a cognate ligand for Fgfr2, and Msx2 gene expression was significantly suppressed via a protein synthesis. To gain further insight into the significance of this down-regulation, Msx2 was overexpressed in the osteoblasts using adenovirus containing Msx2 gene tagged with hemagglutinin (HA) epitope. An RT-PCR analysis showed that the overexpression of Msx2 inhibited the increase of the endogenous osteocalcin gene expression induced by Fgf9. Subsequent gel-shift assays revealed that Msx2 overexpression blocked the binding of Cbfa1/Runx2 on the cognate sequence (OSE2) in the presence of Fgf9. Moreover, overexpression of Msx2 followed by transfection with 6XOSE2-luciferase construct resulted in reduced transcriptional activity of the promoter in the presence of Fgf9. From these results, we propose a possible model of osteoblast differentiation with integrated Fgf/Fgfr and Msx2 function, implicating the suppressive role of Fgf/Fgfr on Msx2 expression by modulating the Cbfa1/Runx2, leading to increased osteocalcin transcription.
URI

http://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/128669
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2. 학위논문 > 2. College of Dentistry (치과대학) > 박사
Yonsei Authors
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