Viral vector mediated insulin gene expression in liver of diabetic rats

Abstract

[한글]

당뇨병을 치료하기 위하여 여러 가지 방법들이 시도되어 오고있으나 만족스럽지 못한 실정이다. 현재로서는 식후의 혈당을 조절하기 위한 방법과 기저치의 인슐린을 공급하는 방법을 적절하게 조합하여 시행되고 있다. 이 연구는 기저치의 인슐린을 제공하기 위하여 실행하고 있는 하루 두세 번 정도의 인슐린 주사법을 대신하여 유전자 요법으로 일정한 양의 인슐린을 공급하는 것을 목적으로 하였다. 구조적인 프로모터하에 퓨린에 의해 잘려지는 휴먼 프로인슐린을 아데노 바이러스와 아데노 수반 바이러스 벡터를 이용하여 스트렙토조토신에 의해 유도된 당뇨백서의 간문맥에 주입하고 혈당변화와 인슐린의 발현을 측정하였다. 아데노 바이러스를 이용한 유전자요법으로 혈액내의 인슐린농도를 증가시켜 당뇨백서에서 공복시의 고혈당을 개선하였고 아데노 수반 바이러스를 이용한 유전자 요법에 의해 3 개월이상 고혈당 상태에 있던 당뇨백서의 공복혈당이 정상으로 변화되었으며 당 분해능력과 당화 헤모글로빈 농도가 현저히 개선되었다. 유전자 요법이 실행된 백서에서 공복시의 혈중 인슐린의 농도 또한 일정하게 증가되어 기록되었다.

치료된 백서의 간에서 추출한 mRNA를 이용한 역전사 효소 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 과 연쇄반응의 생산물의 뉴클레오타이드 분석을 통해 전달된 휴먼 프로인슐린 유전자의 발현을 확인하였다. 유전자 치료된 당뇨백서의 간조직과 췌장조직에서 면역조직염색법을 통하여 스트렙토조토신으로 췌도가 대부분 파괴되었음을 확인하였고 간에서 생성된 인슐린에 의하여 혈당강하의 효과가 나타났음을 보여주었다. 치료된 백서의 여러 가지 조직에서 추출한 RNA를 가지고 노던 블러팅을 실행한 결과 주입된 유전자의 발현이 간 조직에서 이루어졌음을 보여주었다. 이상의 결과로 구조적인 프로모터를 이용한 유전자 요법의 실행은 식후 혈당의 변화를 조절하기에는 제한적이었으나 일정한 양의 인슐린을 발현하고 공급함으로써 공복 상태의 고혈당을 개선하고 혈중 인슐린의 양을 증가시키는 것에 성공적인 결과를 보여주었다. 또한 아데노 수반 바이러스벡터를 이용한 유전자 치료법은 한번의 주입으로 오랜 기간동안 외부 인슐린 유전자를 발현함으로써 안정적이고 비교적 안전한 유전자 치료법임을 시사하였다.

[영문]A lot of therapeutic approaches to cure diabetes have been tried but still remains unsatisfied. The present treatments for diabetes involve frequent monitoring of blood glucose and life-long insulin injection or alternate combination with diabetic medicine. This research purposed to express furin-cleavage human proinsulin in liver of diabetic animal using adenovirus and adeno-associated virus (AAV) and to provide constant insulin level for basal requirement in diabetes. Adenovirus and adeno-associated virus expressing furin-cleavage human proinsulin (AAV-FhPI) under CMV promoter were administered into portal vein of streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats. These resulted in the decrease of blood glucose levels within 24 hr after adenovirus injection and within 3 day after AAV injection respectively. In adenovirus-FhPI treated rats, serum insulin levels were increased and glucose tolerance was significantly improved although these effects lasted for less than 3 weeks. For a long-term insulin gene expression, AAV-FhPI was administered in STZ-induced diabetic rats and the treated rats exhibited the normalized blood glucose levels in fasting state over 3 months. The ability of glucose clearance approximated to non-diabetic control and the hemoglobin A1c concentrations were decreased in AAV-FhPI treated rats. Immunohistochemical studies of pancreas in adenovirus-FhPI treated rats and AAV-FhPI treated rats revealed the pancreatic β-cells were mostly destroyed while adenovirus-FhPI and AAV-FhPI transduced hepatocytes produced human insulin. In conclusion, viral vector-mediated furin-cleavage proinsulin gene expression using the constitutive promoter is feasible gene therapy to supply basal insulin, lessening the frequency of insulin injection. And portal vein injection is suitable to enhance the exogenous gene delivery into liver. Furthermore, the therapeutic potential of this approach would be realized through the study on regulating insulin secretion, for example, regulating promoter-based gene expression with glucose

insulin responsible elements.