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암세포주에서 광역동치료에 의한 사멸효과와 Paclitaxel 전처치에 의한 상승효과

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[한글] 광역동치료(Photodynamic therapy, PDT)는 특정 파장의 빛에 의하여 활성화되는 광활성물질(Photosensitizer)을 투여한 뒤 레이저를 조사하여 조직에 흡수된 광활성물질로부터 생성되는 반응성산소종(Reactive oxygen species)에 의한 세포사멸(cell death)을 기전으로 한다. 암조직을 선택적으로 파괴할 수 있고 효과가 우수하다는 장점이 있어 식도암, 두경부암, 담관암, 자궁경부암 등에서 이용되고 있으며, 새로운 광활성물질의 개발과 레이저 장비의 발전에 따라 적용범위가 확대되어 가는 추세에 있다. 광역동치료 후 세포의 사멸은 괴사(necrosis) 또는 아포토시스(apoptosis)에 의하여 유발된다고 이해되고 있으나, 광활성물질의 생화학적 특성과 세포 내 분포위치에 따라 작용기전에 차이를 보이기 때문에 이에 대한 연구가 더 필요하다. 광역동치료가 많은 장점을 가지는 것은 사실이나, 빛의 투과도에 따라 작용 범위가 제한된다는 문제점이 있으며 세포사멸을 유도할 수 있는 최대 깊이는 1.0 cm로 알려져 있다. 따라서 진행암에서는 완전관해를 얻기 어려우며 1.0 cm가 되지 않더라도 투과되는 빛이 충분하지 않으면 암세포가 완전히 사멸하지 않아 재발하는 원인이 된다. 광역동치료의 효과를 증가시키기 위하여 여러 방법이 실험적으로 시도되고 있으나 확실한 상승효과를 보이는지는 불분명하다. 상이한 기전에 의하여 작용하는 항암제를 병합함으로써 상승효과를 유발할 수 있다면 임상적으로 매우 유용하다. 본 연구에서는 암세포주를 이용하여 실험실에서 광역동치료를 시행함으로써 세포사멸 효과와 기전을 규명함과 아울러 G2-M 세포주기 정지를 유발하는 항암제인 paclitaxel을 전처치 함으로써 효과를 상승시킬 수 있는지 분석하였다. ATCC에서 구입한 위암 세포주 NCI-N87과 저자 등이 수립한 담관암세포주 YGIC-6B를 이용하였고, 할로겐 램프를 광원으로 이용하였으며, 광활성물질은 적색파장의 빛에 의하여 활성화되는 verteporfin을 이용하였다. 암세포주에 verteporfin을 투여하였을 때, 양에 비례하여 미만성의 세포질 흡수를 보였고 대부분의 verteporfin이 미토콘드리아에 위치하는 것을 확인하였다. 광역동치료에 의한 세포사멸 효과는 조사한 광량에 비례하였고, 광량의 IC25, IC50은 NCI-N87 세포에서는 각각 309, 565mJ/cm2이었고 YGIC-6B 세포에서는 각각 236, 451mJ/cm2이었다. 현미경 소견상 광역동치료 4시간 후부터 배양 용기 면에 대한 부착이 느슨해지면서 원형으로 모양이 변화하였고, 24시간 뒤에는 대부분의 세포가 사멸하며 용기 바닥에서 이탈하는 양상을 보였다. 광역동치료 후 시행한 DAPI 염색에서는 전형적인 아포토시스의 소견이 관찰되었고, 치료 1시간 뒤 전기영동 상 DNA의 절편이 확인되었으며, flow cytometry상 subG1 분획의 증가가 관찰되어 아포토시스의 유발이 확인되었다. 광역동치료 후 caspase 3, 8, 9의 활성화가 관찰되었고, 조기에 세포질로 유리되는 cytochrome C를 Western blot immunostaining으로 확인하였으며, Bax나 Bid의 활성화는 관찰되지 않아 미토콘드리아에서 시작되는 아포토시스임을 확인하였다. Paclitaxel을 전처치 한 경우에는 광역동치료 단독군과 비교하여 현저하게 사멸효과가 증가되었으며, 생존곡선을 이용하여 분석한 증강지수는 NCI-N87, YGIC-6B 세포주에서 각각 1.25, 1.21이었다. Paclitaxel 전처치에 의한 증강효과를 DAPI 염색, flow cytometry, DNA 절편으로 분석하였을 때, 아포토시스가 조기에 더욱 강하게 유도됨을 확인하였다. Paclitaxel 전처치 후 시행한 cytochrome C, Bax, Bid의 Western blot immunostaining 상에서도 광역동치료 단독군과 마찬가지로 미토콘드리아에서 시작되는 아포토시스의 활성화가 확인되었다. 이상의 결과로 광역동치료는 미토콘드리아로부터 cytochrome C의 유리를 매개로 하여 아포토시스의 활성화를 유발하며, paclitaxel의 전처치는 광역동치료의 효과를 상승시키는 효과적인 방법으로 임상에서의 적용이 기대된다.
[영문] The effect of photodynamic therapy (PDT) is based on the reactive oxygen species generated by the activated photosensitizer after irradiation with light of specific wave length. As the PDT is relatively tumor selective, safe, and effective, the indications have been broadened. The mechanism of cell death depends on the photosensitizer (PS) used, because the intracellular location of the PS differs according to the biochemical characteristics of them. While the PS principally untaken to mitochondria induce rapid apoptosis, those to cell membrane cause cell necrosis. Verteporfin is one the drugs those accumulate in mitochondria and cause apoptosis in cancer cells. Though PDT has many advantages over other anticancer treatment, one of the pitfalls of PDT is the limited depth of tumoricidal effect that the maximal depth of light penetration is less than 10 mm. Development of new PS activated by longer wavelength is one of the solution and combination of other drugs or molecule to potentiate the PDT effect is another measure. The paclitaxel exerts its anticancer effect by inhibition of microtubule depolymerization and causes G2-M cell-cycle arrest. Recently we found that PDT on cancer cell in vitro causes modest G2-M accumulation, which suggests the possibility of synergistic effect by combination of paclitaxel and PDT. To investigate the cell-cidal effect and mechanism of cell death induced by PDT, and to define whether pretreatment of paclitaxel can enhance the cell-cidal effect of PDT, we carried out in vitro study in cancer cell lines, NCI-N87 and YGIC-6B. In vitro administration of verteporfin revealed diffuse cytoplasmic uptake in a dose-dependent manner by cancer cells, especially in mitochondria, which was confirmed by confocal microscopy after doubling staining with Rhodamine 123 and verteporfin. PDT induced light dose-dependent cell death in both cell lines and the IC25 and IC50 were 309, 565 mJ/cm2 in NCI-N87 and 236, 451 mJ/cm2 in YGIC-6B cells. Microscopic inspection after PDT revealed loosening of cellular attachment to culture dish and rounding of shape at 4 hours, and complete detachment and cell death at 24 hours. The main mechanism of cell death was apoptosis, as increased subdiploid fraction, appearance DNA fragment, and increased TUNEL positive cells were defined after PDT. We also documented the activation of caspase 3 and 9 by western blots and colorimetric analyses of activity. The principal pathway leading to apoptosis was thought to be mitochondrial release of cytochrome C as immediate increment cytosolic fraction of cytochrome C without activation of Bax or Bid was noted by Western blot. When fixed dose (IC25) of paclitaxel was pretreated, the cell-cidal effect of PDT markedly increased in both cell lines, which was more than additive effect. To estimate the effect of paclitaxel on PDT enhancement, we combined fixed drug doses (IC25) with increasing light doses of PDT in each cell line. The cell-survival data were normalized to compensate the drug effect. We calculated the IC25 and IC50 in PDT alone and PDT pretreated with paclitaxel. PDT enhancement ratio was obtained by dividing IC value of PDT alone by that of pretreatment. When the ratio was more than 1.0, we could say the drug enhanced the PDT effect. The calculated enhancement ratio was 1.25 in NCI-N87 and 1.21 in YGIC-6B cells. Flow cytometry also revealed marked increment of subdiploid fraction when paclitaxel was pretreated. The process of cell death of apoptosis was hastened and enhanced by paclitaxel pretreatment, which was documented by DNA fragmentation analysis and DAPI staining. Cytochrome C release from mitochondria was more prominent in paclitaxel-pretreated PDT. From these results, we conclude that PDT using verteporfin induces cell death by apoptosis mediated by direct release of cytochrome C from mitochondria and it may be enhanced by pretreatment with paclitaxel before PDT. In addition, this is encouraging because this method can be directly applied in clinical field, and further studies will be needed to document PDT-enhancement effect of paclitaxel by in vivo study.
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