제대혈 CD34 양성 조혈모세포로부터 거핵구 분화유도와 이에 따른 거핵구의 미세구조 분석

Abstract

[한글]

조혈모세포 이식원 중의 하나인 제대혈은 저장이 용이하고 이식편대숙주병을 적게 유발하는 점 등 여러 장점을 가지고 있다. 그러나 제대혈은 조혈모 세포의 수가 적고 이식 후에 혈소판 회복이 지연된다는 제한점이 있다. 최근에는 이를 극복하고자 thrombopoietin

(TPO)을 비롯한 여러 종류의 사이토카인을 이용한 거핵구 계열로의 체외증폭에 대한 연구가 시도되고 있으나 주로 세포의 표현형에 근거한 실험이고 미세구조변화에 대한 연구는 아직 이루어진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 제대혈 CD34+ 세포를 TPO과 최근 그 유용성이 제기되고 있는 flt3-ligand (FL), interleukin (IL)-3, IL-11, stem cell factor (SCF)의 조합(TPO, TPO+FL, TPO+FL+SCF, TPO+FL+IL-3, TPO+FL+IL-11)을 이용하여 체외증폭을 시키고, 이 과정에서 거핵구 계열세포로의 분화 및 세포고사를 유세포분석과 광학, 전자현미경 관찰을 통하여 종합적으로 분석하였다.

그 결과 TPO만으로 체외증폭시켰을 때에는 세포고사에 의해 11일 이후에는 생존 세포수가 급격하게 감소하였다. 반면 사이토카인을 병용하였을 때에는 모두 2주 후부터 50배 이상으로 증폭되었다. CD61+CD14- 분획은 TPO 단독 투여시 배양 4일째부터 나타나 9일째에

최고조에 달했다가 14일부터 감소하였다. 이러한 양상은 TPO과 함께 각각의 사이토카인 조합을 투여했을 때에도 동일하였다. 그러나 TPO을 제외시켰을 때에는 거핵구로의 분화를 관찰할 수 없었다. Annexin V를 이용한 세포고사 분석에서 세포고사는 TPO 단독 투여시와 TPO과 FL, IL-3, IL-11 등의 조합을 투여시 배양 4일째부터 나타나 배양 14일째에 최고에 달하였으며 특징적으로 SCF를 첨가하면 배양초기에는 비거핵구 계열세포의 세포고사를 유도하는 반면 배양후기에는 오히려 거핵구 계열세포의 세포고사를 억제하는 효과를 보였다.

광학현미경 소견상 뚜렷한 거핵구로의 분화는 사이토카인의 조합에 관계없이 배양 7일경부터 관찰되기 시작하였다. TPO만 투여했을 때에는 배양 14일째에 소수의 거핵구 계열세포와 탐식세포만이 관찰되었다. 반면에 다른 사이토카인을 첨가했을 때에는 18일 째에도

다수의 거핵구 계열세포와 다른 미성숙 세포들이 혼재되어 관찰되었다.

전자현미경으로 관찰하였을 때 TPO 단독 투여시 배양 7일부터 분획막의 출현과 함께 혈소판의 출현을 관찰할 수 있었다. 배양 9일부터는 거핵구 계열세포의 세포고사가 관찰되었다. 특징적으로 SCF를 첨가하였을 때 배양 7일째부터 비거핵구 계열 세포의 세포고사를 확인 할 수 있었고, IL-3을 첨가했을 때에는 배양후기까지 지속적으로 특정 분화를 보이지 않는 미성숙 세포가 나타났으며 분획막의 발달이 거의 관찰되지 않았다. IL-11과 FL를 첨가했을 때에는 14일째까지는 미세형태소견이 TPO 단독 투여했을 때와 같았고, 18일째에는 거핵구 계열 세포와 함께 미성숙 형태의 비거핵구 계열의 세포를 함께 관찰할 수 있었다.

결론적으로 TPO은 제대혈 CD34+ 세포로부터 거핵구 세포로의 체외증폭에 필수적이며,TPO 이외의 사이토카인은 부가적인 효과가 있음을 확인할 수 있었다. SCF는 TPO과 병용시 배양 초기에 비거핵구 계열세포의 세포고사는 증가시키지만, 배양후기에 거핵구 계열세포

의 세포고사를 억제하여 거핵구의 성숙 및 혈소판 생산을 항진시켰다. IL-3는 TPO에 의한 거핵구 계열로의 분화를 오히려 저해하였고, IL-11과 FL는 세포의증식효과만을 나타내었다.

[영문]

Cord blood (CB), as an alternative source of hematopoietic stem cells (HSCs), has many advantages, that include among others ease of banking and low incidence of graft versus host disease. However, insufficient number of HSCs and delayed engraftment, especially delayed platelet recovery, are the potential limitations to the widespread use of CB for marrow replacement. Recently, cytokine-mediated ex vivo expansion, especially using thrombopoietin (TPO), has been evaluated to overcome these limitations. However, the findings of most of these works are based on immunophenotypic analyses lacking the ultrastructural details of the megakaryocytopoiesis during ex vivo expansion of CB cells. We therefore examined the ultrastructural details of the megakaryocytopoiesis by light and electron microscopy (EM) as well as by flow cytometric analyses during ex vivo expansion of

CB CD34+ cells that have been induced by TPO, TPO+flt3-ligand (FL), TPO+FL+stem cell factor (SCF), TPO+FL+interleukin (IL)-3, and TPO+FL+IL-11.

Our results documented that when so induced the number of viable cells increased by more than 50-fold except where the inducing agent was TPO alone. Where cultures were treated with TPO alone, CD61+CD14- megakaryocyte (MK) fraction began to appear on day 4 and achieved its maximum cellularity over the following five days before being declined from day 14 onwards. However without TPO, EM examination as well as flow cytometric analyses did not demonstrate any evidence of the differentiation of CB CD34+ cells into MKs. Apoptosis as determined by staining the cells with annexin V began to appear from day 4 before being reached its peak on day 14. When induced by SCF, apoptotic fractions involving mostly cells of non-MK lineage were increased during the early phase. However, during the late phase of SCF induction, there was a decrease in apoptosis involving cells of MK lineage that have been induced by TPO.

On light microscopic examination, definite evidence of MK differentiation could be noted from day 7. The cultures that had been induced by TPO for 14 days were sparsely cellular with macrophages admixed occasionally with intact MKs. This is by

contrast when cultures were induced by a combination of any of the above-mentioned cytokines that resulted in a exuberant cellularity comprising many platelet-forming MKs as well as immature cells of non-MK lineage on day 18.

EM examination revealed demarcation membranes and platelet territories on day 7 in

the cultures that had been induced by TPO alone. The first evidence of apoptosis began to appear on day 9. While addition of SCF hastened the appearance of apoptosis in cells of non-MK lineage from day 7, it retarded apoptotic process in MKs that had been induced by TPO. Under the induction of IL-3, cellular population comprising poorly characterized immature cells appeared, the presence of which could be demonstrated until the late stage of incubation. In the cultures that had been induced by a combination of TPO, FL, and IL-11, MKs admixed with immature

cells of non-MK lineage were present until day 18. However, prior to day 14, ultrastructural details of cultures were similar irrespective of whether induced by TPO alone or in combination with other cytokines listed as above.

In conclusion, although the combined effects of the above cytokines seemed to be additive on expansion of MK lineage cells from the CB HSCs, TPO was essential for megakaryocytopoiesis. When combined with TPO, SCF appeared to have the strongest

inducing influence on megakaryocytopoiesis as it induced apoptosis of non-MK cells at early stage and suppressed apoptosis of MKs at later stage. While IL-11 and FL had an positive effect on the expansion of cellulrity, IL-3 seemed to have retarded megakaryocytopoiesis.