마우스 복강 및 토끼 폐포 활성 macrophage에서 과산화대사에 관한 연구

Abstract

[한글]

Macrophage의 식균작용시 과산화대사가 증가된다는 사실이 널리 알려져 있으나 이에 대한 정확한 기전은 아직 분명치 않다. Cagan과 Karnovsky(1964)는 식세포 대사중에 생성되는 H^^2 O^^2 및 O^^2는 산소분자와 NADPH에 NADPH-oxidase의 촉매작용으로 형성된다고

보고하였으며, 이 효소의 중요성을 지적하였다. Vogt등(1971)은 토끼 폐포 macrophage의 식작용시 NADPH 증가와 더불어 hexose monophosphate shunt증가는 glutathione peroxidase의 증가를 수반하고 있음을 밟혔다. 최근 Nakagawara등(1982)은 마우스 림파구에서 얻은 lymphokine 이 human polymorphonuclear leukocy에 작용하여 반응력이 강한 산소 중간 대사물질을 분비시킴을 보고하였다.

이상의 보고들을 종합해 볼 때 식세포의 과산화대사 촉진은 NADPH-oxidase가 관여하고, glutathione shuttle에 연관된 hexcse monophosphate shunt의 활성화를 통해 NADPH생성을 도모하고 있는 것으로 믿어진다. 따라서 본인은 마우스복강 macrophage와 토끼폐포 macrophage를 이용하여 BCG^^1 lymphokine, latex bead 등으로 이들 macrophage를 활성화시키고 이때 일어나는 생화학적인 변화를 관찰함과 동시에 NADPH-oxidase의 특성구명과 lymphokine 생물학적 성질을 밝히고자 본 실험에 착수하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 마우스 복강 macrophage는 latex bead에 의하여 incubation 후 10∼30분 사이에 H^^2O^^2 생성이 현저히 증가하며, H^^2O^^2 생성을 촉매하는 NADPH-oxidase 는 주로 macrophage의 membranes(plasma membrane 과 microsomal membrane)에 분포되어 있다.

2. BCG주사군과 단독 mineral oil주사군에서 마우스 복강 macrophage NADPH-oxidase활성도는 이 두 군사이에는 별 변동이 없었으나 비활성 대조군에 비하여 모두 약 4배 증가하였다.

3. Concanavalin A는 비활성 대조군의 마우스 복강 macrophage NADPH-oxidase활성을 높였고 마우스 lymphocyte에서 BCG자극으로 분리된 lymphokine은 NADPH-oxidase활성을 각군에서 모두 증가시켰으며 특히 BCG로 활성화된 마우스에서 의의있게 증가하였다.

4. 대조군에서 분리한 NADPH-oxidase는 FAD(0.01mM), C^^a Cl^^2(0.5mM) 그리고 M^^n Cl^^2(0.5mM)에 의하여 활성이 증가하였으며 FAD의 효과가 가장 높았다.

5. 토끼의 폐포 macrophage NADPH-oxidase활성도는 BCG주사군에서 2.6배의 증가를 보였으며 catalase와 glutathione peroxidase의 활성도는 BCG주사군이 대조군에 비하여 약간 높았다.

6. 토끼의 lymphocyte에서 분비된 lymphokine을 분리한 후 SDS전기영동한 결과 35개의 단백질 band가 나타났고 BCG와 접촉시킨 임파구에서 분비된 lymphokine에서도 같은 수의 단백질 band가 나타났으나 단백질양(106.8㎍/10**5cells)은 대조군(92.7㎍/10**5cells) 비하여 약간 높았다.

7. 마우스 복강 macrophage에서 분리 정제한 NADPH-oxidase의 분자량은 약 158,000이었으며 이 효소의 NADPH에 대한 Km은 25μM이며 NADH에 대한 Km은 475μM이었다.

이상 본 실험 결과로부터 macrophage는 외부로부터 침입한 이물질이나 이로 인해 분비되는 lymphokine이 비특이적으로 macrophage의 membrane에 주로 분포되어 있는 NADPH-oxidase를 활성화시켜 H**2 O**2생성을 증가시키고 증가된 H**2 O**2는 이물질의 파괴에 사용됨과 동시에 glutathione peroxidase system을 활성화시켜 hexose monophosphate shunt를 증가시키고 NADPH 합성을 촉진시키는 것으로 사료된다.

[영문]

Although it has been well known that peroxidative metabolism in macrophage increased during phagocytosis, the real mechanism is still obscure. Cagan and Karnovsky (1964) have reported that H^^2 O^^2 and 0^^2**- are produced during phagocytoais from the reaction of O^^2 and NADPH catalized by NADPH-oxidase which is an important enzyme in peroxidative metabolism. Vogt et al (1971) had shown that increases of NADPH and hexose monophosphate shunt accompanied with the increase of glutathione peroxidase activity during Phagocytosis of rabbit alveolar macrophage.

Recently, Nakagawara et al (1982) have reported that lymphokine obtained from mouse lymphocytes stimulated human polymorphonuclear leukocytes to release reactive oxygen intermediates.

From these reports, it is believed that the increase of peroxidative metabolism is related to NADPH-oxidase and glutathione peroxidase system ahuttled to hexose monophoaphate shunt through which NADPH is generated. Therefore, the author

designed an experiment in order to investigate the biochemical change in mouse peritoneal macrophagea and rabbit alveolar macrophages activated by BCG, lymphokine and latex beads, and to characterize the nature of NADPH-oxidase and lymphokines.

Following results were obtained from the study and summarized as fellows:

1. When mouse peritoneal macrophages were incubated with latex beads, H^^2 O^^2 release was markedly increased during 10∼30 minutes after incubation, and NADPH-oxidase which catalizes the reaction for the production of O^^2 was localized mainly in membrane fractions(plasma membrane and microsomal membrane).

2. NADPH-oxidase activities in mouse peritoneal macrophages from BCG immunized group and mineral oil injected group were similar but the activities were 4 times higher than those of non-activated control group. Concanavalin A increased NADPH-oxidise activity in mouse peritoneal macrophage.

3. Lymphokines releases from mousse lymphocytes stimulated by BCG, increased NADPH-oxidase activities in all groups, and it had a significant effect in macrophages of mouse immunized with BCG.

4. NADPH-oxidase in mouse peritoneal macrophage of control was activated by FAD(0.01mM), CaCl^^2(0.5 mM) and MnCl^^2(0.5 mM). Among these, FAD had the strongest effect.

5. NADPH-oxidase activity in rabbit alveolar macrophage increased 2.6 folds when the animal was immunized with BCG, and activities of catalase and glutathione peroxidase were slightly higher in BCG immunized group compared to that of the control.

6. Lymphokines released from rabbit lymphocytes were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and 35 prothin bands were appeared on the gel. There was no difference in protein bands between BCG stimulated group and the non-stimulated control, but the amount of protein in BCG stimulated group was

slightly higher (106.8 ㎍/10**5 cells) than that of non-stimulated control(92.7 ㎍/10**5 cell).

7. NADPH-oxidase isolated from mouse peritoneal macrophage had a molecular weight of 158,000 and the Km of this enzyme for NADPH was 25 μM and the Km for NADH was 475 μM.

From these results, it is believed that lymphokine released from lymphocytes stimulated by foreigh bodies invaded, activates NADPH-oxidase localized on macrophage membranes nonspecifically, and the activated NADPH-oxidase enhanced the H^^2 O^^2 production which is used for the destruction of foreign bodies while the

increased H^^2 O^^2 activates glutathione peroxidase system linked to hexose monophosphate shunt to generate the NADPH.