PC12 세포에서 PDTC에 의한 세포사멸 유도시 NF-kB와 MAPK의 활성 변동

Abstract

[한글]

Nuclear factor kappa B (NF-^^kB)는 염증과 면역반응, 세포의 생존과 사멸, 종양발생 (oncogenesis), 형질전환 (transformation)에 관련된 유전자의 발현을 조절하는 전사 조절 단백질로서 tumor necrosis factor a(TNFa), cytokine, 성장인자, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 등의 세포분열 물질, 세균 독소, 바이러스 등의 자극에 의해 활성화되어 여러 종류의 cytokine, 성장인자, 면역수용체 등의 전사를 조절한다. NF-kB의 신경세포의 생존과 사멸에 대한 역할에 대해서는 사멸을 유도한다는 설과 생존을 유도한다는 설로 나뉘어져 아직도 논란이 되고 있다. Pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)는 항산화제로서 효과를 발휘하여 NF-kB의 활성화를 방해하는 것이 보고되었고, 반면에 산화촉진제로서 작용하여 NF-kB를 산화시켜 DNA 결합을 방해한다는 보고도 있다. 그 외 금속이온 chelator, superoxide dismutase (SOD)의 방해제로서의 작용도 보고되었다. 또한 NF-kB, AP-1, p53 등의 전사조절물질의 DNA 결합부위의 thiol group을 변화시켜 그들의 활성도를 변화시킨다는 보고도 있다.

본 연구에서는 신경세포에서 기원된 PCl2 세포에서 NF-kB 방해제로 알려진 PDTC 자극에 대해서 세포의 생존 및 NF-kB의 활성도에 미치는 영향과 신호전달 기전을 알아보기 위해서 세포의 생존 및 사멸에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려진 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 들이 어떻게 관여되어 있는가를 연구하였다. PDTC는 PCl2 세포에서 농도변화에 따라 이중적으로 세포사멸을 유도하였으며, 이는 전사조절인자 NF-kB의 DNA 결합 활성도 변화와 연관성을 갖고 조절되는 것을 확인하였다. 100 μM 이하의 PDTC를 세포에 처리하면 세포사멸이 농도 의존적으로 증가하였고, 이때 NF-kB의 DNA 결합활성도는 농도 의존적으로 감소하여서 세포사멸이 최대로 일어나는 100 μM에서 NF-kB DNA 결합활성도도 최대로 감소되었다. 250 μM 부터 500 μM의 고농도에서는 PDTC에 의한 세포사멸 유도 효과가 오히려 감소하였고 농도가 증가할수록 100 μM에서 최대 억제되었던 NF-kB의 DNA 결합활성도도 증가하였다. 이러한 100 μM PDTC에 의한 세포사멸 유도 효과는 glutathione, L-cysteine, N-acetylcysteine과 같은 thiol agent나 금속이온 chelator인 bathocuproline disulfonic acid에 의해 봉쇄되고 감소된 NF-kB의 DNA 결합활성도도 회복되는 것을 관찰하였다. 혈청이 배제된 상태에서 여러 농도의 PDTC첨가는 세포생존 및 NF-kB의 DNA 결합활성도에 별 영향을 미치지 못하였으나, 아연 혹은 구리이온을 같이 처리하여 주면 세포사멸이 농도 의존적으로 증가하고 NF-kB의 DNA 결합활성도가 현저하게 감소하는 것을 관찰하였다. 또한 PDTC에 의한 세포사멸 유도시 신호변환기전을 알아보기 위해 MAP kinase family 구성원들의 활성도를 측정한 결과, 세포사멸이 일어나는 100 μM PDTC를 기준으로 extracelluar signal-regulated kinase (ERK)의 활성도는 감소하고, c-Jun N-terminal kinase (JNK)의 활성도는 증가하였으며, 농도변화에 따라 각각 선별적으로 활성도가 조절되었다. 한편 p38 kinase의 활성화는 관찰할 수 없었으며 PDTC에 의한 MAP kinase의 활성도 조절도 thiol agent나 금속이온 chelator에 의해 조절되는 것을 관찰하였다.

이러한 결과로부터 PDTC에 의한 세포사멸은 아연이나 구리같은 금속이온에 의해 매개되고, 이러한 PDTC의 작용에 세포내 단백의 thiol group의 변화, NF-kB의 DNA 결합 활성도의 조절, MAP kinase 신호변환체계의 선별적인 활성화가 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.

[영문]

Nuclear factor kappa B (NF-kB) is a transcription factor involved in the expression of a wide range of genes, most of which code for proteins that play a role in immunity, inflammation, apoptosis, transformation, and oncogenesis.

Recently it was reported that NF-kB might be either protective or detrimental, depending on the onset and duration of its activation and on the circumstances in which it was activated. Pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) is a well-known NF-kB inhibitor. Although its action mechanism was conferred by its antioxidant properly, other mechanisms by which PDTC could act as a prooxidant, metal chelator, and free thiol group modulator of NF-KB binding site have been recently suggested.

In the present study, it was investigated whether PDTC could induce the change of cell viability and how it could couple to the activation of NF-kB and MAP kinase.

It was found that PDTC caused a dual effect of cell death and survival in neuronal PCl2 cells, depending on its concentration. At low concentration PDTC caused cell death, generating maximum 60-70% cell death at 100 μM within 24 hrs. But over 100 μM to 500 μM, its cytotoxic effect was reduced in a dose-dependent manner. The cytotoxic PDTC effect was blocked by thiol agents such as glutathione, L-cysteine, and N-acetylcysteine and divalent metal ion chelator, bathocuproline disulfonic acid. When zinc and copper ions were co-administrated with 25 μM PDTC, which did not show any significant effect on the viability of serum-depleted PCl2 cells, these ions potentiated the toxic effect of PDTC in a dose dependent-manner. The differential effect of PDTC on cell viability correlated well with the inhibition of NF-kB activities. In addition, PDTC differentially activated ERK and JNK and they are also modulated by thiol agents and metal ions. Taken together, these results suggest that the thiol groups and free zinc and copper ion levels are important for the novel biphasic PDTC effect on cell viability, which is associated with the differential activation of NF-kB and MAP kinases.